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目的:手足口病是由二十多型肠道病毒引起的常见传染病,目前仅肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)有上市疫苗,难以控制手足口病的流行。鉴于肠道病毒型间交叉反应性时有报道以及肠道病毒型间序列的高度同源性,本研究首先探讨EV71灭活疫苗对手足口病多种病原的交叉保护作用,明确EV71疫苗预防其他手足口病病原的价值;其次,本研究利用具有交叉中和作用的EV71表位VP1-SP70和VP2-141,以及兼具佐剂活性和外源基因投递能力的耻垢分枝杆菌作为载体,构建可预防多种肠道病毒的基因重组耻垢分枝杆菌疫苗,探讨耻垢分枝杆菌用于构建手足口病疫苗的价值。方法:1.扩增培养18个型别肠道病毒分离株,测定其滴度;EV71灭活疫苗免疫大鼠制备抗血清,微量中和试验检测抗血清中EV71中和抗体效价及对其他手足口病病原的交叉中和抗体效价。PCR扩增肠道病毒P1片段后进行序列测定,测序结果用clustalx软件多序列比对后利用MEGA6构建系统进化树。2.以质粒pC149/mut-HBc-E1/2为模板,PCR扩增嵌合EV71中和表位VP1-SP70(E1)和VP2-141(E2)的融合基因HBc-E1/2。将HBc-E1/2分子克隆至大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒PMV261,获得重组质粒PMV261-HBc-E1/2。重组质粒电穿法转化耻垢分枝杆菌菌株mc2155,构建重组耻垢分枝杆菌mc2155:HBc-E1/2,SDS-PAGE和Western Blot验证HBc-E1/2在重组耻垢分枝杆菌的表达。结果:1.微量中和试验显示,EV71灭活疫苗的抗血清针对EV71的中和效价为1024,对手足口病其他17型肠道病毒,仅对CA6、CA9、CB4、ECHO6、ECHO11、ECHO14、ECHO30和ECHO33有交叉中和作用,其中对CA9的中和效价为16,对其他毒株的中和作用较弱;进化分析显示,有交叉中和作用的肠道病毒大多为B组肠道病毒分离株,只对与EV71同为A组的CA6分离株有一定的中和作用。2.通过SDS-PAGE和Western Blot对重组耻垢分枝杆菌mc2155:HBc-E1/2的蛋白表达进行验证,25KD和50KD(二聚体)处出现目的蛋白,并且VP1-SP70和VP2-141两个表位均高效表达。结论:1.EV71灭活疫苗免疫大鼠的抗血清对CA6、CA9、CB4等部分肠道病毒具有微弱的交叉中和作用,交叉中和能力与亲缘关系远近无明显关系。2.成功构建表达HBc-E1/2的重组耻垢分枝杆菌疫苗mc2155:HBc-E1/2,为后续疫苗免疫原性和保护性研究奠定基础。