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第一部分:TGF-?1预处理在BMSC凋亡过程中的作用引文:BMSC即骨髓间充质干细胞,是存在于骨髓基质中的非造血组织的间充质干细胞,它具有向多种中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的能力。在机体受到外伤,疾病,老化等损伤时,BMSC可增殖分化,并可释放神经营养因子,如BDNF(脑源性神经营养因子),NGF(神经生长因子),并参与神经组织损伤的修复。BMSC主要应用于移植,但是在单纯移植BMSC后,BMSC易受到各种外界环境因素的影响而凋亡,不能较好地参与组织损伤修复过程。本研究应用小剂量转化生长因子-β1对BMSC进行预处理,观察小剂量转化生长因子-β1预处理是否使BMSC具有抗凋亡的能力。目的:观察经TGF-β1预处理后的BMSC凋亡的情况,并筛选出使BMSC具有最强抗凋亡能力的条件,即TGF-β1预处理的时间点和浓度。方法:选取对数生长期的P2代BMSCs ,用DMEM培养基培养24小时后,改用含0. 5 %新生小牛血清的培养液继续培养24小时,使细胞趋于同步化。将骨髓间充质干细胞悬液稀释成5×104/ml,接种在6孔细胞培养板中,每孔10ml细胞悬液,分为预处理组及空白对照组,分别在预处理组的各孔中加入2ng/mlTGF-β1,不加TGF-β1为空白对照组,预处理组又分为TGF-β1预处理后24小时,48小时,72小时组。再将各组细胞改用无血清培养基(作为一种诱导凋亡的条件)培养48小时,并用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。结果:1.体外分离纯化的骨髓MSCs,所挑取的单克隆扩增细胞呈典型成纤维样细胞形态.2.光镜下观察发现BMSC在TGF-β1预处理后12小时开始凋亡,24小时呈继续上升趋势,48小时时凋亡细胞数开始减少,72小时凋亡细胞数又继续增多。3.经24小时,48小时,72小时预处理组的细胞凋亡率(AI%)分别为33.5% , 23.2 % ,52.2 %。4.相应的空白对照组在24小时,48小时,72小时的细胞凋亡率(AI%)分别为31.2% ,47.2% ,56.3%。结论:经2ng/ml TGFβ-1预处理48小时后的骨髓间充质干细胞具有较强抗凋亡能力。经2ng/ml TGFβ-1预处理48小时的BMSC可以在无血清培养基中生存48个小时。TGF-β1在特定条件下对骨髓间充质干细胞具有保护作用,可以抑制其凋亡,提高BMSC在移植过程中的存活率。第二部分:TGF-?1预处理对抗BMSC凋亡作用机制的研究引言:细胞凋亡是细胞的死亡形式之一, caspase在诱发凋亡过程中是起着必不可少的作用,而Bcl-2基因及其蛋白则是抑制细胞凋亡的重要物质。本研究用免疫组化方法检测经小剂量TGF-β1预处理后的骨髓间充质干细胞中BCL-2和Caspase-3的表达,旨在探讨小剂量转化生长因子-β1预处理使BMSC具有抗耐受凋亡的能力的原因及机制。目的:通过检测经TGF-β1预处理后的骨髓间充质干细胞中BCL-2和Caspase-3的表达,研究小剂量转化生长因子-β1预处理具有对抗BMSC凋亡的作用机制。方法:将骨髓间充质干细胞悬液稀释成5×104/ml,接种在6孔细胞培养板中,分为预处理组及空白对照组,置37℃,5%CO2培养箱中培养,分别于24小时、48小时、72小时后,收集细胞并制备细胞爬片.免疫细胞化学染色检测BCL-2,caspase-3的表达。每种抗原的染色均分实验组和对照组。常规免疫细胞化学染色。阳性标准为棕黄色。各随机抽取10个不重叠的视野,计算阳性细胞的数量,应用HPIAS21000高清晰度彩色病理图文报告分析系统,对BCL-2,caspase-3的表达结果进行分析。结果: BMSCs BCL-2,Caspase-3的表达:BCL-2,CAS-3染色阳性部位在细胞膜和细胞浆,将3个预处理时间点的2组细胞进行免疫组化染色分析,并分别取5个不同视野,进行阳性细胞记数。24小时和72小时处理组的BCL-2表达及CASPASE-3表达较对照组差异显著性不明显(P>0.05).48小时处理组的BCL-2表达较对照组显著增加(P<0.05), Caspase-3较对照组显著减少(P<0.05)。结论:经2ng/ml的TGFβ-1预处理48小时的BMSC具有较强抗凋亡能力,其机制可能与增强BCL-2及减少Caspase-3表达密切相关。