柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是一种单细胞胞内寄生虫,也是严重危害养鸡业的重要病原之一。目前对于球虫病的防治,仍主要依靠于药物。球虫病防治药物主要分为两大类:离子载体类抗生素和化学合成药物,马杜拉霉素(Maduramycin)和地克珠利(Diclazuril)是这两类药物中比较具有代表性的药物。在长期用药物控制球虫病的同时,球虫极易对药物产生耐药性,为球虫病的防治带来了困境。为了能揭开球虫耐药性神秘的面纱,实验室前期通过药物诱导获得了马杜拉霉素耐药株和地克珠利耐药株。为了探索球虫的耐药机制,本文利用RNA-seq方法比较了柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素耐药株和地克珠利耐药株与敏感株的差异,筛选出差异基因,分析了差异基因的相关功能,对差异表达基因膜骨架蛋白1(IMC1)的特性进行了初步研究,为深入研究球虫的耐药机制奠定了一定基础。1.柔嫩艾美耳球虫2个耐药株的耐药性检测为确定实验室长期保存的柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素耐药株和地克珠利耐药株的遗传稳定性,采用鸡体试验法,以抗球虫指数(ACI)、最适抗球虫活性百分率(POAA)、病变记分减少率(RLS)和相对卵囊产量(ROP)4项指标,评价2个耐药株对地克珠利、癸氧喹酯(Decoquinate)、马杜拉霉素等3种抗球虫药物的耐药性,并以柔嫩艾美耳球虫敏感株为对照。结果显示,敏感株对3种抗球虫药物均无耐药性,4项指标全部阴性。马杜拉霉素耐药株对马杜拉霉素为完全耐药,4项指标全部阳性。地克珠利耐药株对地克珠利为完全耐药,4项指标全部阳性。结果表明,在实验室已繁殖保存10余年的柔嫩艾美耳球虫2个耐药虫株对其诱导药物具有完全耐药性,实验室保种繁殖方法可行,虫株遗传稳定性良好,为利用该虫株进行球虫耐药性相关研究奠定了基础。2.基于RNA-seq方法进行柔嫩艾美耳球虫耐药株与敏感株差异基因的筛选利用RNA-seq方法筛选柔嫩艾美耳球虫2个耐药株与敏感株之间的差异基因,对耐药株与敏感株孢子化卵囊进行转录组测序与分析,筛选差异基因,与柔嫩艾美耳球虫基因组数据库进行比对,进行差异基因的功能分类。结果显示,地克珠利耐药株与敏感株相比,上调基因330个,下调基因49个。马杜拉霉素耐药株与敏感株相比,上调基因672,下调基因398个。马杜拉霉素耐药株与地克珠利耐药株相比,上调基因8个,下调基因20个。这些差异基因的生物学功能主要集中为参与代谢过程、生物调节、细胞形成、运输过程、生物合成、基因表达等,研究结果为探讨球虫耐药性产生的分子机制打下了坚实的基础。3.柔嫩艾美耳球虫膜骨架蛋白1基因功能特性的初步研究根据柔嫩艾美耳球虫耐药株与敏感株转录组分析比较结果,选取耐药株与敏感株的差异表达下调基因膜骨架蛋白1(IMC1),利用RT-PCR扩增技术,以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板克隆IMC1,经过PCR和酶切鉴定正确后测序,将测序正确的序列连接到原核表达载体pGEX-4T-2中,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-EtIMC1,并在大肠杆菌BL21中诱导表达,获得重组蛋白rEt IMC1,纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,用RT-q PCR和Western-blot检测EtIMC1在耐药株和敏感株中的转录水平和表达水平。结果显示,EtIMC1在地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株中的转录水平显著低于敏感株,蛋白在耐药株中为低表达,转录与表达水平趋势一致。间接免疫荧光检测发现该蛋白位于虫体表面,体外抑制试验结果显示用抗rEtIMC1多克隆抗体孵育后的子孢子入侵DF-1细胞,其入侵率比对照组下降80%。研究结果提示,EtIMC1的低表达可能有助于在药物作用前期帮助球虫逃避药物的损害,以及提高对药物损害的抵抗能力,同时Et IMC1可能在子孢子入侵宿主细胞过程中发挥了重要作用。本研究为阐明球虫耐药性产生的分子机理提供了一定基础。