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生物药剂学分类系统(BCS)是基于药物溶解性和肠渗透性测定的药物分类预测系统,故准确测定药物的肠渗透性是保证药物科学分类的首要前提,也是预测药物在动物体内吸收情况的重要参数。美国FDA颁布的BCS指南中推荐使用CaCo-2细胞和大鼠肠灌流实验测定药物的渗透性,且规定了 一系列可作为渗透性判断标准的内参药物。但是目前有关兽药BCS分类及兽药渗透性测定的体外方法仍未开展。本试验率先选取FDA推荐的高渗透性内参药物美托洛尔,建立鸡在体肠灌流模型,探讨不同pH、不同肠段、药物的不同灌流浓度等因素对药物肠渗透性测定的影响。同时选取MDCK和MDCK-chAbcb1细胞进行美托洛尔渗透性的测定,探讨pH、转运药物浓度和转运蛋白对细胞模型测定药物渗透性的影响,并采用优化的灌流模型和细胞模型进行了几种常用药物渗透性的测定,最后研究了槲皮素对美托洛尔转运的影响。该研究结果可为兽用药物BCS分类时渗透性测定方法的建立奠定基础,并为研究药物间或药物-食物间相互作用提供参考方法。具体内容如下。‘实验首先选用3周龄的健康AA白羽肉鸡,研究不同pH、不同肠段和灌流浓度对美托洛尔在鸡肠道有效渗透性测定的影响,初步建立鸡单向在体肠灌流方法。结果显示:采用不同肠段各自生理pH条件测定美托洛尔(μg/ml)渗透性时,在回肠测得的有效渗透率(Peff)极显著高于十二指肠和空肠测得的Peff(P<0.01)。采用不同pH进行测定时,发现十二指肠在灌流液pH为5时测得的美托洛尔Peff极显著或显著高于pH为6(P<0.01)和7(P<0.05)时的Peff,即随pH值升高,美托洛尔的有效渗透性有上升趋势;采用空肠在pH为5,6和7时测得的Peff虽有一定波动,但差异并不显著(P>0.05);回肠测定时发现在pH为5和6时测定Peff差异不显著,但pH上升至7时测定的Peff显著高于pH为5时测定的Peff(P<0.05),提示不同pH对美托洛尔在十二指肠和回肠测定Peff时影响较大,而对空肠影响较小。不同肠段在相同pH时测定的美托洛尔药物渗透性并无显著变化(P>0.05)。此外,选择空肠探讨不同美托洛尔浓度对其渗透性测定的影响,结果显示随灌流液中美托洛尔浓度升高,其渗透性呈明显上升趋势,表现一定的浓度依赖性,美托洛尔浓度为400μg/ml极显著高于40 μg/ml和4 μg/ml(P<0.01)的渗透性。综合考虑大多数药物主要在空肠吸收,且美托洛尔在空肠测定渗透性时较为稳定,故初步确定采用pH=7时于鸡空肠进行单向在体肠灌流测定药物的渗透性。在此条件下,测定了几种常用药物(克林霉素、伊维菌素、环丙沙星、多西环素、阿莫西林)的Peff,结果显示5种测定的药物中,盐酸多西环素和环丙沙星的渗透性最高,其次为克林霉素和阿莫西林,伊维菌素最小。我们进一步探讨了鸡肠道中高表达的外排泵转运蛋白P-gp对药物渗透性测定的影响,为此我们选取MDCK细胞和本实验室构建的高表达鸡源P-gp的MDCK-chAbcb1细胞,采用单层细胞双相转运实验测定不同pH、不同转运浓度(4、40和400 μg/mL)和转运蛋白抑制剂对内参药物美托洛尔渗透性(Papp)的影响。结果显示:美托洛尔的净外排率(NER)≥2,并且P-gp抑制剂维拉帕米可逆转MDCK-chAbcb1对美托洛尔BL-AP的Papp,证实美托洛尔为P-gp的底物,增加美托洛尔浓度可逃避P-gp对其的外排作用。美托洛尔在MDCK和MDCK-chAbcb1细胞测得的AP-BL侧的Papp均存在浓度依赖性,其在40 μg/mL和400 μg/mL浓度时测得的Papp均极显著高于4 μg/mL时的Papp(P<0.01);但BL-AP侧的Papp未表现出明显的浓度依赖性,结果提示测定P-gp底物药物的Papp时,不宜在低浓度进行。不同pH对MDCK和MDCK-chAbcb1细胞测定美托洛尔Papp时也会产生影响,随pH升高AP-BL侧的Papp均呈现上升趋势。最后我们分别采用体外细胞系和鸡在体肠灌流模型研究了槲皮素对美托洛尔转运的影响。首先,采用不同浓度的槲皮素(10、50、100 μM)预处理MDCK和MDCK-chAbcb1细胞24 h,然后测定其对美托洛尔Papp的影响。结果显示MDCK细胞转运4μg/ml美托洛尔时,AP-BL侧渗透性在10 μM和100μM槲皮素处理后极显著上升(P<0.01),BL-AP侧10、50、100 μM处理组较对照组均极显著上升(P<0.01);转运40 μg/ml美托洛尔时,AP-BL和BL-AP侧渗透性均无明显变化,但外排率均极显著上升(P<0.01)。MDCK-chAbcb1细胞转运4 μg/ml美托洛尔时,经槲皮素处理AP-BL侧渗透性均无明显变化,但BL-AP侧当槲皮素达100 μM时会显著上升(P<0.05),两侧外排率较对照组均极显著增加(P<0.01);40 μg/ml时,其AP-BL侧渗透性在10 μM和50 μM槲皮素处理组显著上升(P<0.05),两侧外排率均极显著增加(P<0.01)。当分别用15 mg/kg和60 mg/kg的槲皮素连续口服饲喂鸡5 d和10 d后,用400 μg/ml美托洛尔进行空肠单向在体灌流,结果显示处理组细胞的美托洛尔渗透性均极显著低于对照组细胞渗透性(P<0.01)。10 d槲皮素的处理组美托洛尔空肠渗透性低于5 d;处理5 d和10 d的槲皮素15 mg/kg组的美托洛尔渗透性均低于60 mg/kg组。槲皮素对伊维菌素肠渗透性的影响结果显示:口服不同剂量槲皮素(15 kg/mg和60mg/kg)分别处理5d和15 d后,用400μg/ml美托洛尔在空肠段灌流,槲皮素虽可增加伊维菌素空肠肠道灌流液的浓度,但渗透性变化差异不显著(p>0.05)。综上结果,我们初步建立了鸡空肠肠道单向在体灌流模型和细胞模型,二者在测定药物渗透性时均应考虑待测药物浓度、pH以及转运蛋白的影响。通过两个模型的验证,提示檞皮素可对P-gp底物美托洛尔和伊维菌素的转运产生影响,介导药物间相互作用产生。