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食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率居世界恶性肿瘤的第六位,而食管癌的浸润转移又是引起食管癌患者死亡的主要原因,因此深入研究食管癌浸润转移的机制并探索有效的抗转移治疗措施是目前食管癌诊治中的重点和难点,对食管癌的防治具有重大意义。Rho (Rashomologue)家族成员(RhoA、RhoB和RhoC)是一类与Ras同源的三磷酸鸟苷(Guanosine triohosphte, GTP)结合蛋白,研究表明,RhoC基因的高表达与肿瘤的浸润转移及血管生成密切相关。近年来,先后有文献报道,RhoC高表达或活性升高与乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、非小细胞肺癌和胃癌等多种肿瘤的侵袭转移密切相关。有关RhoC在食管鳞癌中的表达及其与浸润、转移的关系,迄今国内外尚无系统性研究报道。为深入探讨RhoC基因与食管鳞癌发生和浸润转移的关系,寻找抑制食管鳞癌发生和浸润转移的有效方法,本研究首先采用RT-PCR、原位杂交及免疫组化SP法联合检测了食管鳞癌、癌旁不典型增生及正常食管粘膜组织中RhoC mRNA和蛋白的表达水平;采用免疫组化SP法检测了食管鳞癌、癌旁不典型增生及正常食管粘膜组织中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达情况,同时用CD105抗体检测食管鳞癌组织中微血管密度(Mi-crovascularDensity, MVD),探讨了RhoC表达与VEGF、MVD的相关性。在此基础上,成功构建了pRNAT-U6.1-siRhoC干扰表达载体,并将其稳定转染至食管癌EC9706细胞中,以建立RhoC基因“敲弱”(knockdown)的细胞模型,运用boyden chamber侵袭实验观察转染后细胞体外侵袭力的改变;采用Westernblot、RT-PCR、免疫细胞化学及原位杂交等实验方法检测了转染前后RhoC蛋白及mRNA的表达变化;同时采用免疫组化法检测了干扰RhoC的表达对VEGF的影响。最后通过裸鼠移植瘤实验,采用原位杂交、RT-PCR及免疫组织化学方法检测裸鼠移植瘤组织中RhoC基因的表达,并采用免疫组织化学方法检测移植瘤组织中VEGF的表达,从体内角度观察RhoC基因对裸鼠移植瘤的作用及其对VEGF表达的影响,试图阐明RhoC的表达在食管鳞癌发生、发展及浸润、转移中的意义;并进一步阐明食管鳞癌中RhoC基因与血管生成之间的关系,以期为食管癌的靶向治疗提供理论依据。本研究共分以下3个部分。第一部分RhoC、VEGF及CD105在食管鳞癌组织中的表达及其意义方法1.采用RT-PCR、原位杂交、免疫组织化学等技术分别检测RhoC基因在62例食管鳞癌、31例癌旁不典型增生及62例正常食管粘膜组织的表达情况。2.采用免疫组化SP法检测血管内皮细胞生长因子(VEGF)在62例食管鳞癌、31例癌旁不典型增生及62例正常食管粘膜组织中的表达情况,同时用CD105抗体检测食管鳞癌中的微血管密度(MVD)。3.统计学处理:应用SPSS13.0软件处理,采用χ2检验、t检验和方差分析,并利用Spearman进行相关性分析。检验水准α=0.05。结果1. RhoC mRNA及蛋白阳性表达主要定位于食管癌细胞的胞质内,在正常食管粘膜组织内无表达或者表达量较弱。2. RT-PCR、原位杂交及免疫组化联合检测RhoC结果显示:在正常食管粘膜、癌旁不典型增生和食管鳞癌组织中,RhoC mRNA表达水平依次升高,三者组间比较差异有统计学意义(P<0.05),其蛋白的阳性表达率亦依次升高,三者组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。3.在深层浸润组和有淋巴结转移组的食管鳞癌组织中,RhoC mRNA、蛋白的表达显著高于浅层浸润组和无淋巴结转移组,组间比差异均有统计学意义(P<0.05)。4.在Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级食管鳞癌组织中RhoC mRNA、蛋白表达的结果显示,分化程度越低,其阳性表达越高,组间比差异有统计学意义(P<0.05)5. RhoC mRNA、蛋白的表达与食管癌患者的性别、年龄无关(P>0.05)。第二部分pRNAT-U6.1-si RhoC干扰表达载体的构建及其对人食管癌细胞株EC9706细胞生物学行为的影响方法1.设计三对RhoC基因的反义寡核苷酸片段和一对无义序列,经过退火及酶切后,克隆入RNA干扰表达载体pRNAT-U6.1,体外扩增纯化后,得到重组构建的pRNAT-U6.1-siRhoC干扰表达载体。2.通过脂质体2000介导将pRNAT-U6.1-siRhoC干扰表达载体转染食管鳞癌EC9706细胞,利用G418筛选稳定表达株。3.采用PCR、Western-blot、原位杂交、免疫细胞化学等技术,检测转染pRNAT-U6.1-siRhoC1的EC9706细胞内RhoC表达水平的变化。4.采用免疫细胞化学技术,检测转染pRNAT-U6.1-siRhoC1的EC9706细胞内VEGF表达水平的变化。5.应用Boyden Chamber细胞体外迁徙力实验检测转染pRNAT-U6.1-siRhoC1 EC9706细胞侵袭特性的变化。6.统计学处理:应用SPSS11.0软件处理,采用χ2检验、t检验和方差分析。检验水准α=0.05。结果1.PCR鉴定结果表明成功构建了三个siRNA表达载体pRNAT-U6.1-siRhoC1, pRNAT-U6.1-siRhoC2和pRNAT-U6.1-siRhoC3,并筛选出抑制效果最佳的siRNA表达载体pRNAT-U6.1-siRhoC1。2.在转染pRNAT-U6.1-siRhoC1组EC9706细胞内RhoC表达水平显著低于无关siRNA对照组(转染pRNAT-U6.1-siC)及未转染组(P<0.05)。3.在转染pRNAT-U6.1-siRhoC1组的EC9706细胞内VEGF表达水平显著低于无关siRNA对照组(转染pRNAT-U6.1-siC)及未转染组(P<0.05)。4.Boyden chamber体外侵袭实验结果显示:pRNAT-U6.1-siRhoC1转染组EC9706细胞穿越Matrigel胶的细胞数显著减少(P<0.05),而无关siRNA对照组(转染pRNAT-U6.1-siC)及未转染组EC9706穿越Matrigel胶的细胞数无明显差异(P>0.05)。第三部分pRNAT-U6.1-si RhoC干扰表达载体对裸鼠移植瘤生长的影响方法1.分别将pRNAT-U6.1-siRhoC1转染组、无关siRNA对照组及未转染组的食管癌细胞株EC9706注入裸鼠皮下,比较各组裸鼠的成瘤情况及肿瘤大小。2.分别应用RT-PCR、原位杂交、免疫组织化学方法检测各组裸鼠移植瘤组织中RhoC基因的表达情况。3.应用免疫组织化学方法检测各组裸鼠移植瘤组织中VEGF基因的蛋白表达情况。4.统计学处理:应用SPSS13.0软件处理,采用χ2检验、t检验和方差分析。检验水准a=0.05。结果1.在无关siRNA对照组及未转染组中,其裸鼠移植瘤的体积显著大于pRNAT-U6.1-siRhoC1转染组,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。2.在无关siRNA对照组及未转染组裸鼠移植瘤组织内,RhoC蛋白及mRNA的表达均显著高于pRNAT-U6.1-siRhoC1转染组的表达,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。3.在无关siRNA对照组及未转染组裸鼠移植瘤组织内,VEGF的蛋白表达显著高于pRNAT-U6.1-siRhoC1转染组的表达,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.食管鳞癌组织中RhoC蛋白及mRNA均呈明显的高表达,且与食管鳞癌的浸润转移及组织学分级密切相关,提示RhoC可能是食管鳞癌侵袭、转移的重要生物学标记。2.食管鳞癌组织中,RhoC的高表达可上调VEGF的表达,进而促进肿瘤血管的生成。3.成功构建了pRNAT-U6.1-siRhoC1干扰载体,并将其导入食管鳞癌细胞株EC9706细胞中,成功建立了RhoC基因沉默的细胞株,为进一步研究RhoC的生物学功能和RhoC的靶向治疗奠定了基础。4.体外实验显示,pRNAT-U6.1-siRhoC1可降低EC9706细胞的体外侵袭能力,并可下调EC9706细胞VEGF蛋白的表达。5.体内实验显示,pRNAT-U6.1-siRhoC1具有抑制裸鼠移植瘤生长的作用,并能降低裸鼠移植瘤组织内VEGF蛋白的表达。6.体内外实验的结果表明,通过pRNAT-U6.1-siRhoC1可有效的抑制食管鳞癌的侵袭和转移,为食管癌的靶向治疗提供了新的思路及理论依据。