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研究背景:心血管相关疾病有着极高的发病率与死亡率,急性心肌梗死(acute myocardialinfarction,AMI)属于其急危重症。GATA 结合蛋白 5(GATA binding protein 5,GATA5)是GATA家族的重要成员,通过不同通路参与高血压、房颤、先天性心脏病等心血管相关疾病的发生发展[1-4]。另外,GATA5参与调控细胞代谢[5,6]、冠状动脉发育[7-9]、血管炎症、氧化应激和内皮功能[3,10]等多个AMI相关的病理生理过程。因此,GATA5功能缺陷可增加人群的AMI易感性。研究目的:基于GATA5基因启动子在AMI患者中的遗传与功能变异信息进行分子遗传学研究,以探索GATA5基因启动子突变在AMI发生发展中的作用及其调控机制,有望为AMI的预防、诊断、治疗和发病机制研究提供新的遗传学依据。研究方法:1、遵循纳入-排除标准,共计683例参与者被纳入本次研究,其中AMI患者332例。采集所有参与者3 ml空腹外周血并从中提取基因组。2、参考NCBI中GATA5基因启动子序列设计聚合酶链式反应(PCR)引物,体外扩增目的片段后采用Sanger测序法确定变异位点。3、采用 SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)、SPSS 等在线程序及统计学软件,分析AMI与GATA5启动子单核苷酸多态性(SNP)间的相关性。4、利用TRANSFAC在线预测软件(https://portal.genexplain.com/)预测受上诉变异位点影响的转录因子。5、采用瞬时转染的实验方法,以pGL3与pRL-TK为被转染载体,以HEK-293和H9c2为被转染细胞,用以明确GATA5启动子变异位点对其生物学活性的影响。6、凝胶迁移率变异实验(EMSA)用于检测各突变位点是否干扰某个(些)转录因子与GATA5基因启动子的结合,并应用转录因子特异性抗体确定受变异位点影响的转录因子。研究结果:1、在683例参与者GATA5基因启动子中,共发现9个变异位点。其中3个新的杂合突变(g.62476323-24GG>AA,g.62476197G>A 和 g.62476046G>A)和 3 个 SNPs[g.62476171C>T(rs1341970027),g.62476123A>G(rs1435326263)和 g.62475977 C>G(rs1294169077)]在 5 例 AMI 患者中被发现。另外 3 个 SNPs[g.62476317G>A(rs80197101)、g.62476223C>T(rs77067995)和 g.62476271A>C(rs145936691)]在两组人群中均可被发现,值得注意的是,g.62476317G>A(rs80197101)和 g.62476223C>T(rs77067995)在 42 例 AMI 患者和 25 例对照者中被发现(X2=6.459,P=0.040;X2=6.459,P=0.040),而 g.62476271 A>C(rs145936691)在两组中的分布相似(P>0.040)。2、Hardy-Weinberg 平衡检验显示 rs80197101 和 rs77067995 符合 Hardy-Weinberg平衡(AMI组:P=0.722,P=0.722;健康对照组:P=0.489,P=0.489),说明我们纳入的样本具有良好的代表性,且来自于遗传平衡的群体。卡方分析显示rs80197101的“A”和rs77067995 的“T”在 AMI 组分布更高(X2=6.128,P=0.013;X2=6.128,P=0.013);Logistic分析示,校正各混杂因素后,rs80197101“GA”和“GA+AA”依然与AMI相关(OR=2.263,95%CI:1.009～5.079,P=0.048;OR=2.297,95%CI:1.028～5.135,P=0.043),rs77067995“CT和“CT+IT”也依然与 AMI 相关(OR=2.263,95%CI:1.009～5.079,P=0.048;OR=2.297,95%CI:1.028～5.135,P=0.043);连锁分析示 rs80197101、rs77067995呈完美连锁不平衡(D’=1.000,r2=1.000);单倍型分析示rs80197101、rs77067995形成的“AT”在 AMI 组的分布更高(OR=1.875,95%CI:1.132-3.106,P=0.013)。3、TRANSFAC应用程序预测受突变所干扰的某个(些)转录因子,g.62476323-24 GG>AA可能消除了 E2F相关因子和AP-2与GATA5启动子相结合的位点;g.62476197G>A可能改变了 ZFP161的结合域;g.62476046G>A可能改变了 AP-2和Kruppel-like factor 4(KLF4)的结合域;g.62476171C>T(rs1341970027)可能消除了 LRH-1 and Steroidogenic factor-1(SF-1)group 的结合域,创建了 transcription factor 7(TCF7)相关因子的结合域;g.62476123A>G(rs1435326263)新增了 BEN 的结合域;g.62475977C>G(rs1294169077)可能消除了 Nuclear receptor subfamily 1 group H member(FXR)的结合域;g.62476317G>A(rs80197101)可能消除了 Kruppel-like factor 6(KLF6)的结合域;g.62476223C>T(rs77067995)可能新增了 Small mothers against decapentaplegic(SMAD)在GATA5启动子的结合域。4、HEK-293细胞和H9c2细胞的转染数据均表明,pGL3-62475977G和pGL3-62476046A 显著降低了 GATA5 启动子活性(P<0.01),pGL3-62476197A、pGL3-62476123G、pGL3-62476323-24AA、pGL3-g.62476171T 和pGL3-62476317A+62476223T 显著升高了 GATA5 启动子活性(P<0.05),pGL3-62476271C并没有改变GATA5启动子活性(P>0.05)。5、EMSA 分析发现,位点 g.62476323-24GG>AA,g.62475977C>G(rs1294169077),g.62476317G>A(rs80197101),g.62476197G>A,g.62476223C>T(rs77067995)均显著改变了某反式作用因子与GATA5启动子的结合,但g.62476046G>A,g.62476171C>T(rs1341970027)和 g.62476123A>G(rs1435326263)并未影响其结合。研究结论:1、GATA5启动子变异可通过改变反式作用因子(如:E2F related factors、AP-2、FXR、KLF6、SMAD与ZFP161等)与GATA5启动子相应结合域的结合而影响其活性,进而通过改变GATA5表达水平,增加AMI易感性。2、Rs80197101位点的“A”和rs77067995位点的“T”为AMI的危险性等位基因,两者形成的“AT”,为AMI的危险性单倍型。