论文部分内容阅读
休克是临床常见急症,由各种致病因素引起有效循环血量下降、致使组织和重要器官灌注不足,最终导致各组织细胞损伤以及重要脏器功能障碍。失血性休克(hemorrhagic shock)是休克类型之一,在失血性休克的发展过程中,会引起肠道屏障功能障碍和肠内细菌/内毒素移位(bacteria/endotoxin translocation、BET),导致肠源性感染,进而引起肺、肝、心、肾等多个器官的功能改变,诱发多器官功能障碍综合征(multipleorgan dysfunction syndrome,MODS),严重威胁着人类生命,常常导致病人死亡。失血性休克致器官损伤的发生机制可能与休克引起失控的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)以及肠源性内毒素血症等环节有关。淋巴学是循环系统研究的薄弱领域,长期以来,一直认为淋巴途径是血液循环回流的辅助部分。肠淋巴循环与休克的发生、发展及转归关系密切,阻断失血性休克复苏后肠系膜淋巴液回流,可改善休克大鼠心、肺、肝、肾等重要器官的功能,减轻组织学损伤,降低死亡率,可见肠淋巴途径在失血性休克致多器官损伤的发病学中具有重要作用,以肠淋巴途径为干预靶点,可能是危重病防治的有效途径之一。心脏泵功能的状态对于能否改善失血性休克后的微循环障碍具有重要作用,因此,改善心肌功能对于休克的防治具有重要作用。
目的:本研究通过复制重症失血性休克大鼠模型,制备休克淋巴液(lymph of shock,LS)、休克门静脉血浆(portal vein plasma of shock,BPS);以正常大鼠作为对照,提取正常淋巴液(normal lymph,LN)和正常门静脉血浆(normal portal vein plasma,BPN);建立乳鼠心肌细胞的原代培养技术,并以浓度为4%的LS、BPS、LN和BPN作为干预因素,对原代培养48h后的乳鼠心肌细胞进行干预,观察心肌细胞的活性,并观察休克淋巴液对心肌细胞NF-κB表达的影响,探讨休克淋巴液通过NF-κB信号途径造成心肌细胞损伤的可能机制,为进一步研究休克状态下的心肌损伤提供实验依据。
方法:大鼠肌注1%的戊巴比妥钠(50 mg/kg)全身麻醉,无菌手术,行右侧颈总动脉动脉和左侧颈静脉插管,颈静脉注射0.5%肝素(500U/kg),全身抗凝。自颈总动脉缓慢放血(失血量以全血量的1/5计,全血量以体重1/13计),3 min完成,以无菌林格式液瓶作为Lamson瓶,连接无菌输液器,将液面调整至固定高度,维持低血压(40 mmHg)90 min,复制大鼠重症失血性休克模型,此后,以微量输液泵自左侧颈静脉缓慢回输放出之血液及林格氏液(量为全血量),时间>20 min。复制大鼠失血性休克模型,部分大鼠行肠系膜淋巴管插管,引流重症休克期肠系膜淋巴液,时间为2h左右,量为0.5 mI左右,离心取上清液,储存于-80℃冰箱内备用;其它大鼠行门静脉插管,制备休克门静脉血浆。此外,应用正常雄性大鼠同法肠系膜淋巴管插管或门静脉插管,制备正常淋巴液及门静脉血浆,作为对照。
选择出生1-3天的SD大鼠,在超净工作台上,无菌开胸,暴露并剪取大鼠心脏,分离并培养心肌细胞,原代培养48小时后对乳鼠心肌细胞进行干预,分别4%LS、4%BPS、4%LN和4%BPN作为干预因素,分为四个实验干预组,以无干预因素的原代心肌细胞作为正常对照组,各实验组在干预因素作用24h后,显微镜下观察心肌细胞的活性与形态学变化,裂解心肌细胞分别提取RNA和蛋白,采用RT-PCR和Western-blot方法,检测NF-κB在乳鼠心肌细胞中的表达。
心肌细胞分离培养48 h后,应用不同的干预因素,可见心肌细胞形态无明显变化,但是随干预时间延长,心肌细胞死亡逐渐增加,休克淋巴液干预组在24 h时死亡率达到50%,心肌细胞之间的连接减弱,其搏动频率也出现不同一性,搏动频率在15-150次/min不等,甚至细胞搏动消失,逐渐死亡。
结果:在正常门静脉血浆与休克门静脉血浆组间、正常门静脉血浆与休克淋巴液组间、正常门静脉血浆与正常对照组组间、休克门静脉血浆与休克淋巴液组间、休克门静脉血浆与正常淋巴液组间、休克门静脉血浆与正常对照组组间、休克淋巴液与正常淋巴液组间、休克淋巴液与正常对照组组间的。NF-κB表达有显著性差异(P<0.05),正常门静脉血浆与正常淋巴液组间,正常淋巴液与正常对照组组间的NF-κB表达无显著性差异(P>0.05)。而休克门静脉血浆和休克淋巴液间有显著性差异,二者分别相对于正常门静脉血浆、正常淋巴液、无干预组三者而言,休克淋巴液对心肌细胞中NF-κB含量的表达影响更为明显,NF-κB的表达出现增加。
结论:休克淋巴液对心肌细胞有直接破坏作用,减弱心肌细胞的活性,加重心肌细胞损伤。休克淋巴液损伤心肌细胞的作用机制与上调NF-κB的表达有关。