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脑中风又称“脑卒中”,中医将其列为“风、痨、臌、膈”四大疑难病之首,具有高发病率、高致残率、高死亡率及高复发率的特点,是威胁老龄化社会的主要疾病之一。醒脑静注射液由经典凉开名方“安宫牛黄丸”化裁而来,由麝香、栀子、冰片、郁金组成,可清热解毒,凉血活血,开窍醒脑,在临床上是治疗急性脑中风的一线中成药制剂。由于注射途径给药常使用不便,不良反应发生率较高;而口服给药需病人神志清醒,且生物利用度较低,入脑较慢,影响中风需速效救急的治疗特点。因此,应开发一种新型给药途径的新剂型,既保障患者用药的顺应性和安全性,又能迅速起效并具有较强的脑靶向性,具有突出的临床应用价值。实验室前期研究已证明,与注射给药相比,醒脑静鼻腔给药具有显著的脑靶向性;已完成醒脑静鼻用微乳的制备工艺等相关研究;考虑到微乳中药物及表面活性剂对鼻黏膜的刺激性,实验室前期以mPEG2000-PLA嵌段共聚物替代部分表面活性剂修饰醒脑静微乳,在一定程度上降低了微乳鼻黏膜刺激性。本课题拟以醒脑静微乳(XM)为对比,从体内药动学及组织分布方面探讨醒脑静mPEG2000-PLA共聚物修饰微乳(XMM)中有效成分经鼻入脑的药动学特征和递药主要途径,评价mPEG2000-PLA对提高载药微乳长循环及脑靶向的可能性。具体内容如下:1 XM与XMM有效成分的体外释放研究首先建立了 GC-FID测定龙脑和麝香酮含量的方法学,采用透析法对两种微乳中有效成分龙脑和栀子苷的释放特征进行比较。由结果可知,两种微乳制剂中龙脑12h内释放过程符合Higuchi模型,栀子苷12 h内释放过程符合Weibell模型,XMM中龙脑的累计释放率要显著大于XM中龙脑,两种微乳中栀子苷释放特征无差异;实验过程中没有发现麝香酮有良好的释放,推测其被稳定包载于微乳内相中,释放较慢。体外释放研究在一定程度上探讨了包封于微乳内的亲脂性药物的释放规律,对推测复方药物进入体内的存在形式也具有一定的意义。2XM与XMM经不同给药途径给药后龙脑的血药及脑药动力学研究首先建立了龙脑小鼠体内GC-FID分析方法,采用简便易行的GC法测定生物样品中龙脑的方法,选择液-液萃取法处理血浆和脑组织样品,需生物样品量较少,预处理简便快速。与空白生物样品进行比较,生物样品中的龙脑和内标十八烷均分离良好,不受代谢产物及内源性物质的干扰。经方法学验证,线性、精密度、回收率、稳定性均符合要求,此方法可满足两种微乳制剂不同途径给药后龙脑的血药、脑药动力学研究的要求。药动学试验以ICR雄性小鼠为模型动物,鼻腔给药组按4μL/只(即冰片8mg/kg)给药,静脉注射组按0.2mL/只(即冰片8 mg/kg)给药,摘眼球取血,分离全脑,匀浆。采用GC-FID分析方法,对XM及XMM经鼻腔及静脉注射给药后有效成分龙脑血药及脑药动力学过程进行研究。采用Kinetica药动学软件非房室模型计算药动学参数。血药动力学结果表明:各组龙脑Cmax值分别为5.83±1.32μg·mL-1(XM静脉给药Ⅰ),7.28±1.84 μg·mL-1(XMM 静脉给药 Ⅱ),9.02±3.62 μg·mL-1(XM 鼻腔给药 Ⅲ),9.68±2.14μg·mL/1(XMM 鼻腔给药Ⅳ);各组 AUC 值分别为 123.33±35.76μg·mL-1 m(Ⅰ),113.02±43.79 μg·mL-1·min(Ⅱ),154.89±56.07 μg·mL-1·min(Ⅲ),236.62±36.11μg·mL-1·min(Ⅳ)。XM与XMM经鼻腔给药后,可迅速吸收入血(Tmax<2 min),且两者AUC均大于静脉给药,绝对生物利用度F分别为125.59%和209.36%,与实验室前期做的醒脑静滴鼻液鼻腔给药相对生物利用度57.06%相比,两种微乳经鼻入血的程度更高。XMM的AUC和MRT均要显著高于XM,体现XMM更高的入血程度和较慢的代谢,说明XMM鼻腔给药可促进龙脑吸收入血。脑药动力学结果表明:各组龙脑Cmax值分别为11.73±0.9μg·g-1(Ⅰ),10.00±0.79μg·g-1(Ⅱ),2.82±0.58 μg·g-1(Ⅲ),3.63±0.49 μg·g-1(Ⅳ);各组 AUC0-120 值分别为121.38±31.84 μg·g-1·min(Ⅰ),87.50±51.25 μg·g-1·min(Ⅱ),163.36±66.61 μg·g-1·min(Ⅲ),173.32±98.30μg·g-1·min(Ⅳ)。XM与XMM经静脉给药后二者脑药的Cmax均要显著高于鼻腔给药且高于静脉给药后血中浓度,说明静脉给药后龙脑迅速分布于脑中;且XMM静脉给药后血药Cmax值高于XM,脑药Cmax低于XM,推测XMM中引入mPEG链段后微乳与组织结合性降低,减少了组织对微乳油相的捕捉和吞噬,有利于油相中药物实现长循环。两种微乳经鼻腔给药后可迅速入脑,AUC均大于静脉给药,Re值均大于100%(XM134.59%和XMM198.09%),与实验室前期做的醒脑静滴鼻液鼻腔给药Re值(81.42%)、Tmax(6.8 min)相比,说明微乳与滴鼻液相比,经鼻腔给药后龙脑入脑速度更快、程度更高,具有显著的脑靶向优势;微乳鼻腔给药后MRT均显著高于静脉给药,说明微乳在脑内代谢较慢。两种微乳相比较,XM的DTI更高,但XMM鼻腔给药后入血、入脑的程度(F和Re)均大于XM。3XM与XMM经不同给药途径给药后栀子苷的血药及脑药动力学研究本研究以ICR雄性小鼠为模型动物,鼻腔给药组按4μL/只(即栀子苷4.12mg/kg)给药,静脉注射组按0.2 mL/只(即栀子苷4.12 mg/kg)给药,摘眼球取血,分离全脑,匀浆。采用HPLC和UPLC-MS/MS方法分别对XM及XMM经鼻腔及静脉注射给药后有效成分栀子苷血药和脑药动力学过程进行研究。采用Kinetica药动学软件非房室模型计算药动学参数。血药动力学结果表明:各组栀子苷Cmax值分别为4.05±0.61 μg·mL-1(Ⅰ),3.26±0.46μg·mL-1(Ⅱ),1.31±.04μg·mL-1(Ⅲ),1.57±0.81 μg·mL-1(Ⅳ);各组 AUC 值分别为45.72±2.96μg·mL-1·min(Ⅰ),29.72±2.42 μig·mL-1·min(Ⅱ),24.99±3.96 μg·mL-1·min(Ⅲ),30.79±3.13 μg·mL-1·min(Ⅳ)。静脉给药后,XMM的AUC和Cmax值均要低于XM,说明XMM中栀子苷静脉注射后分布于各组织中的趋势和程度均要强于XM;两种微乳鼻腔给药后,XMM的AUC值要显著大于XM(P<0.05),说明XMM栀子苷入血程度更大,可能与其对鼻腔刺激性小有关。XMM的F值明显高于XM,说明微乳修饰后更有利于提高栀子苷鼻腔给药后的生物利用度。脑药动力学结果表明:各组栀子苷Cmax值分别为136.75±43.56 ngg1(Ⅰ),133.60±48.48 ng·g-1(Ⅱ),96.47±13.09ng·g-1(Ⅲ),114.89±23.41 ng·g-1(Ⅳ);各组 AUC值分别为 3654.70±784.18 ng·g-1·min(Ⅰ),3411.22±366.13 ng·g-1·min(Ⅱ),3278.19±181.68 ng·g-1·min(Ⅲ),6424.51±1071.89ng·g-1·min(Ⅳ)。静脉给药后,两种微乳C Cmax值和AUC值无显著性差异,但XMM的Te值(11.48%)要高于XM(7.99%),从而也验证了血药动力学的结论,说明微乳修饰后静脉给药更有利于水溶性成分进入各组织(脑)中,这与文献报道的共聚物有利于药物入脑相符。两种微乳鼻腔给药后,XMM栀子苷普脑药AUC值要显著高于XM(P<0.01),Re值也要高于XM(188.33%和89.70%),说明微乳修饰后,入脑程度更大脑靶向性更加显著。与醒脑静滴鼻液鼻腔给药后栀子苷脑药DTI值(1.29)相比,XM(1.64)和XMM(1.82)均要大于滴鼻液,说明醒脑静制成微乳后,可提高其经鼻腔给药的脑靶向性,且XMM要好于XM。4活体成像初步考察XM和XMM脑内递药特性及组织分布本试验选择脂溶性近红外染料DiR碘化物标记XM和XMM,制备得到载DiR的醒脑静微乳(D-XM)和载DiR的醒脑静共聚物修饰微乳(D-XMM),并对其药剂学性质进行考察,结果显示D-XM和D-XMM各药剂学性质与未加入染料的两种微乳相近,性质稳定;DiR染料具有强脂溶性,在微乳中被包在油相中,且在12h内无泄漏。以CD-1裸鼠为模型动物,分为D-XD鼻腔给药组(Ⅰ),D-XM鼻腔给药组(Ⅱ),D-XMM鼻腔给药组(Ⅲ),D-XM静脉注射给药组(Ⅳ),D-XMM静脉注射给药组(V),DiR溶液静脉给药组(Ⅵ),将(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)组小鼠按4μL/只(即DiR 0.20 mg/kg)给药,(Ⅳ)、(Ⅴ)、(Ⅵ)组小鼠按0.2mL/只(即DiR2.0mg/kg)给药。于给药后不同时间点采用小动物活体成像仪对实验动物进行荧光拍照。拍照后处死实验动物,取脑和各脏器置小动物活体成像仪中进行荧光像采集,比较两种微乳在脑内递药及组织分布特性。由裸鼠活体成像结果可以看出,微乳静脉给药后迅速分布于各组织中,且D-XMM由于mPEG链段的引入,减少了各组织对微乳的吞噬和结合,其与各组织的亲和力要弱于D-XM,这与前面龙脑和栀子苷药动学所得到的的结论是一致的。微乳鼻腔给药后主要进入脑中,脑靶向性显著,且要明显高于静脉给药;与D-XM相比,D-XMM鼻腔给药4h后脑中仍有大量药物存在,说明D-XMM中油相部分药物经鼻吸收入脑过程缓慢且入脑程度更大,可能与其对鼻腔刺激性较小有关。另外,D-XM与D-XMM药物在脑中的分布部位相同,药物主要分布在嗅球,从嗅球往脑内分布逐渐减少,因此推测两种微乳是由鼻经嗅神经通路转运至嗅球。由以上结果可知,醒脑静mPEG-PLA嵌段共聚物修饰微乳鼻腔给药可同时提高脂溶性和水溶性药物的脑靶向性,静脉给药有利于水溶性成分进入组织而减少了脂溶性成分与组织的结合。除此之外,mPEG-PLA嵌段共聚物在微乳中的应用国内外报道较少,本课题对mPEG-PLA在微乳中的应用及其对微乳中药物的影响有一定的指导意义。