苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL, EC 4.3.1.5)是连接植物初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶,是苯丙烷类代谢途径中研究最多的酶,也是苯丙烷途径的关键酶和限速酶,并且与植物的抗逆性直接相关。桑树(Morus alba L.)是一种重要的多年生经济林木,桑叶是桑蚕的主要食物来源,桑叶的产量和质量直接影响蚕茧的产量和质量。依靠常规的育种方法和栽培措施的改善,已很难使桑叶的产量和质量有明显的提高,利用基因工程技术改良桑树品质是当今桑树育种的新方向。苯丙氨酸解氨酶是木质素代谢的关键酶和限速酶,与植物的抗病性直接相关。因此若能在桑树中高效表达此基因,可极大的提高桑树的抗逆性,改良桑叶的品质。因此,开展桑树苯丙氨酸解氨酶的分子生物学研究具有十分重要的意义。本研究以沙2×伦教109杂交桑苗的叶片为材料,利用同源克隆方法成功克隆出pal1和pal2部分cDNA片断,并进行了序列分析。主要研究结果如下:1.本文用改良CTAB法提取其总RNA,电泳检测RNA条带完整、亮度高,RNA提取周期短,应用改进的LiCl沉淀RNA方法,仅需10 min。用该法提取的RNA纯度高,能用于分子克隆等后续分子生物学实验。2.首次从桑树叶片中扩增得到两个PAL基因片段,长度分别为551bp和1105bp,分别编码181个和367个氨基酸,GenBank登录号依次为FJ938355和FJ938356。通过和Genbank核酸序列库中发表的紫花苜蓿(Medicago sativa),榆树(Ulmus pumila) ,烟草(Nicotiana attenuate),甜樱桃(Prunus avium)等PAL的cDNA比较,同源性在69%-88%之间,表明所扩增出来的DNA片段即为PAL基因片段的一部分。3.运用在线Motiff分析系统,得知获得的PAL1氨基酸序列10-15区域GLISSR为PAL的活性位点,属于植物PAL的特征序列;PAL2氨基酸序列34-50区域GTVTASGDLVPLSYIAG为PAL的活性位点,属于植物PAL的特征序列,进一步验证了所得序列均为PAL序列。采用最新的蛋白质二级结构在线分析系统,对PAL2的氨基酸序列进行在线分析,得知该段区域主要由α-螺旋和无规则卷曲构成。4.扩增出桑树未知基因3′端一个,长664 bp,在531 bp处有TGA终止密码子,在650 bp处有个多聚腺苷酸加尾信号,编码176个通读的蛋白质氨基酸序列。同杨树、葡萄的氨基酸序列比对结果表明,与二者同源性较高,编码区末端较保守,保守区域为YPPPPWAATPGY,PSYRLF,GGRK,初步推测该序列为一桑树基因。将该基因在NCBI注册,GenBank登录号为GQ144323。