食管癌是我国高发的恶性肿瘤之一，95％以上为鳞状上皮细胞癌(ESCC)。ESCC早期无明显症状，大多数患者就诊时已失去最佳治疗机会。尽管几十年来，手术和放化疗取得较明显进展，但ESCC恶性程度高，易复发转移，对放化疗不敏感性，其总体五年生存率仍徘徊在15％左右。因此，研究新型辅助治疗手段对改善ESCC患者预后有重要意义，免疫治疗为提高ESCC患者总体生存率带来新的希望。ESCC癌变机理至今未完全清楚，大量研究表明，ESCC与高危型HPVs感染关系密切，HPVs E6/E7癌基因持续表达是感染上皮恶性转化和维持恶性表型的关键，E6/E7癌蛋白是公认的理想靶抗原。本研究以Hu-PBL-SCID小鼠为模型，观察HPV16E6/E7融合蛋白疫苗抑制HPV16 E7阳性ESCC的生长并探讨其机制，为食管癌疫苗研究提供新的思路。 本文采用有限稀释法从食管癌细胞系EC9706中建立了两个亚克隆，EC9706S1和EC9706S2。 Western Blot(以CaSki为阳性对照)显示EC9706S1表达高水平E7，而EC9706S2 E7阴性。流式细胞术分析、生长曲线和平板克隆形成等实验证实：所建立的ESCC亚克隆保持亲本细胞的生物学行为。因此，EC9706S1和EC9706S2分别作为本研究的实验靶细胞和阴性对照。 为了模拟人免疫系统对融合蛋白疫苗产生免疫应答及其对EC9706S1细胞生长的影响，先经腹腔输入人PBLs建立了Hu-PBL-SCID嵌合小鼠模型。ELISA证实：免疫重建两周后，90％小鼠血浆中人IgG达10μg/ml以上。流式细胞术显示小鼠脾脏中存在人CD4<+>和CD8<+>淋巴细胞，小鼠均未出现GVHD。 为进一步明确CTLs杀伤肿瘤细胞的分子机制，用Western Blot分析各组移植瘤中穿孔素/颗粒酶途径、凋亡受体和线粒体途径相关分子变化情况。结果显示：疫苗组肿瘤中PFN、GrB和TNF-α表达水平显著提高，Caspase-3明显激活及PARP剪切；同时Caspase-8也明显活化(出现p18)，提示凋亡受体途径参与GrB介导肿瘤细胞凋亡。Caspase-9出现两种激活片段，p35和p37，说明其既存在自我加工又可能同时受到Caspase-3剪切。进一步观察发现，疫苗组肿瘤中Bcl-2表达水平无明显变化，但Bid明显剪切(p15)；同时胞浆中Smac、Cyt-c含量相对高，而cIAP-1水平降低。更重要的是，体外Caspase-8和Caspase-9活性抑制实验证实Caspase-8抑制剂几乎完全抑制CTL杀伤活性，而Caspase-9抑制后对CTL活性无明显影响。实验还发现：实验肿瘤组织中VEGF表达下调，但各组移植瘤的TGF-β表达水平无明显差异。 结论：1.本研究建立了遗传背景一致，HPVE7高表达和不表达的ESCC细胞株。2.建立了Hu-PBL-SCID嵌合小鼠模型。3.首次证明HPV16 E6/E7融合蛋白疫苗在Hu-PBL-SCID小鼠体内能诱导特异性CTL反应并有效杀伤肿瘤细胞，对HPV16 E7阳性ESCC和CaSki细胞生长有明显抑制作用。4.初步明确融合蛋白疫苗在体内抑制肿瘤生长的分子机制，即CTLs主要通过穿孔素/颗粒酶途径诱导肿瘤细胞凋亡，凋亡受体途径在其中发挥关键作用，而线粒体途径可能与放大凋亡信号作用有关。