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细胞壁关联激酶(WAK)是一类特殊的植物类受体激酶,在结构上,WAK分为胞外域、跨膜域和胞内Ser/Thr激酶结构域,胞外域中存在保守的EGF重复序列,而EGF结构域被认为与细胞信号转导有关。研究证实,在模式植物拟南芥中,AtWAK基因参与了与植物生长发育、信号转导以及生物和非生物逆境胁迫有关的生理反应。应用生物信息学手段已在水稻基因组中注释了大约125个OsWAK基因,其中OsWAK45定位于水稻第4号染色体上,MPSS数据库结果显示其表达模式具有组织特异性,主要在植物生命力旺盛的组织部位,而在成熟部位表达较低;接种稻瘟病菌和白叶枯病菌后基因表达显著上调。
从美国密歇根大学专业水稻数据库(http://ricE.plantbiology.msu.edu/)下载OsWAK45启动子序列和基因全长序列(LOC Os04g30010.1)。以起始密码子ATG前2.2kb的序列构建OsWAK45基因启动子与GUS基因融合的载体,采用农杆菌介导法侵染水稻胚性愈伤组织。获得的抗潮霉素转基因苗再用GUS引物对其鉴别,对获得的阳性苗在正常水培、添加Na、Cd、SA等条件下培养,发现在茎分生组织区有明显的着色,根部伸长区与分生区也有较弱着色,其他如叶,根部成熟区等部位未见GUS染色,外源添加物Na、Cd、SA可以诱导GUS染色反应。
分别按照全长目的基因来设计引物,通过RT-PCR克隆得到OsWAK45 cDNA全长序列,将这段序列装载到带有组成型启动子UBI的表达载体pOX上,构建超表达载体。另外以位于OsWAK45的ORF内从+8位至+645位的片段构建RNAi干涉载体。以超表达和RNAi两条途径分别使OsWAK45基因表达上调或下降,通过转基因水稻在生长发育以及遭受逆境胁迫时的表型来推测该基因的功能。本试验采用了NaCl、SA、和几种重金属离子处理3—5叶期的转基因幼苗,处理结果显示,OsWAK45基因表达上调有助于提高水稻在遭受逆境胁迫时的耐受能力。在自然生长状态下,随着水稻的生长发育表型差异逐渐开始明显,超表达载体转基因植株生长状态优于WT和干涉植株,抽穗结实期也会提前3—5 d;部分干涉植株甚至出现死亡。
综上所述,OsWAK45主要在分生组织区表达,并且该基因的表达对植株对抗环境的不利因素具有一定的作用。