植物生长素通过调控干细胞的再生而诱导体细胞胚胎发生。同时,位于生长素信号转导中心的生长素响应因子受小分子RNA的调控。本研究以龙眼体细胞胚胎发生过程中不同发育阶段的胚性培养物为试验材料,通过RT-PCR和RACE技术克隆小分子RNA及其靶基因生长素响应基因子ARFs,并对其进行生物信息学分析；在此基础上,采用RLM-RACE法鉴定靶基因TAS3、ARF3、ARF4、ARF6、 ARF8、ARF10、ARF16、ARF17的裂解位点；通过实时荧光定量技术检测龙眼体胚发生过程中小分子RNA及其靶基因ARFs的表达情况并对其调控机制做进一步分析。为验证miR39、TAS3和ARFs三者之间的互作关系,进一步通过遗传转化将龙眼TAS3基因在Micro-Tom番茄中过表达,观察再生植株的表型变化并检测miR390、ARF3和ARF4在转基因番茄中的表达情况。本研究主要结果如下：1龙眼体胚miR160、miR167、miR390与TAS3初级体克隆及生物信息学分析以龙眼“红核子”不同胚性培养物为材料,采用RT-PCR技术法克隆获得了龙眼miR160、miR167、miR390、TAS3初级体序列,分别命名为dlo-pri-miR160、 dlo-pri-miR167、dlo-pri-miR390、dlo-pri-TAS3,其大小分别为441 bp、185 bp、 785 bp、579 bp。生物信息学分析表明,dlo-pri-miR 160、 dlo-pri-miR 167、 dlo-pri-miR390、dlo-pri-TAS3均含有典型的二级结构,且自由能比一般植物的平均自由能都较高；系统发育树显示,龙眼miR160、miR167、TAS3初级体分别与番茄(Solanum lycopersicum)、柑桔(Citrus sinensis)、番茄(Solanum lycopersicum)的亲缘关系较近,龙眼miR390与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、葡萄(Vitis vinifera)、大豆(Glycine max)等其他物种的亲缘关系都较远。2龙眼胚性愈伤组织靶基因ARFs的克隆及生物信息学分析以龙眼“红核子”胚性愈伤组织为材料,通过RT-PCR结合RACE法对sRNA调控的靶基因生长素响应基因家族成员进行克隆。成功获得ARF3 (KJ200347.1)、 ARF4 (KJ461667.1)、ARF6 (KJ410230)、ARF8 (KJ410232)、ARF10 (KJ410234)、 ARF16 (KJ410235)、ARF17 (KJ410236) cDNA序列,其大小分别为2561 bp、2698 bp、3381 bp、2868 bp、2093 bp、2279 bp、2098 bp。生物信息学分析表明：在龙眼生长素响应蛋白中,D1ARF3、D1ARF6、D1ARF8、DIARF10、D1ARF16和D1ARF17都属于水溶性蛋白；其中D1ARF6蛋白、D1ARF8蛋白、DIARF10蛋白、D1ARF16蛋白都具有B3-DNA结合区、ARF家族的保守区Auxin_resp和IAA-ARF-dimerisation3种结构域,而D1ARF3蛋白和DIARF17蛋白只具有B3-DNA结合区和ARF家族的保守区Auxin.rresp两种结构域；龙眼生长素响应蛋白ARF6、ARF8中间区域富含谷氨酰胺、丝氨酸和亮氨酸,龙眼生长素响应蛋白ARF3、ARF10、ARF16、ARF17中间非保守区域都不富含谷氨酸(Glu),都具有抑制转录活性；同源性分析表明,龙眼生长素响应基因家族成员都分别与拟南芥生长素响应基因家族成员有很接近的亲缘关系。3龙眼生长素响应因子ARFs及TAS3基因的裂解位点验证为进一步验证龙眼体胚中sRNA与ARFs的调控关系,以龙眼“红核子”松散型胚性愈伤组织、球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚5个不同发育阶段胚性培养物的混样cDNA为模板,采用改良的RLM-RACE法验证靶基因的裂解位点。经测序结果分析,发现miR390靶标的TAS3前体在TTA/TCC位点被切割;而TAS3识别ARF3和ARF4的第二个切割位点,分别为GCA/AGG、CAA/GTT;在ARF6所挑取的18个单克隆子中所裂解的位置都位于龙眼miR167识别位点以外的序列中；而ARF8所挑取的25个单克隆子中只有GCU/GGC这个切割位点位于miR167识别位点序列中；分别挑取miR160的靶基因生长素响应因子ARF10、ARF16、ARF17单克隆子,经分析发现它们有共同的裂解位点为AGG/GAG.4龙眼体胚发生过程中小分子RNA及其靶基因ARFs的定量表达分析采用qPCR技术,分别以龙眼“红核子”品种体胚不同发育阶段培养物、龙眼“四季蜜”品种不同组织器官、2,4-D处理下的龙眼胚性愈伤组织为材料,检测龙眼体胚miR16、miR167、miR390与TAS3初级体及其靶基因ARFs的mRNA转录表达情况。结果表明：在龙眼体胚发育的5个不同阶段中,miR160初级体在球形胚时期的转录水平远远高于其靶基因ARF10、ARF16、ARF17的转录水平,这可能与miR160参与球形胚的形态建成以及对靶基因的负调控有关；但检测不到龙眼miR167初级体的表达信号,其靶基因ARF6与ARF8的表达变化趋势完全相反；龙眼pri-miR390与TAS3初级体在球形胚时期的表达差异较显著；而TAS3初级体与其靶基因ARF4的表达模式较接近的,ARF3的整体转录水平波动较平稳且表达量较低。在龙眼“四季蜜”中,dlo-pri-miR160及其靶基因表达差异较显著的组织器官是种子、根；龙眼pri-miR390、pri-TAS3、ARF3、ARF4在9个组织器官中都有表达,且都在根部中有最高的表达量；虽然检测不到龙眼miR167初级体的表达信号,但其靶基因生长素响应因子ARF6、ARF8在花蕾、根中都有较高的转录水平。在2,4-D处理下的龙眼胚性愈伤组织中,ARF10的表达量明显较高且整体转录水平呈上升的趋势,dlo-pri-miR160与ARF16、ARF17的表达量较低且差异并不显著；dlo-pri-miR167依然没有表达信号,其靶基因ARF6、ARF8随着生长素浓度的增加而升高,两者在0.5 mg/L时的表达差异较显著；dlo-pri-miR390的整体转录水平略低且变化平稳,TAS3初级体在1.0 mg/L、2.0mg/L时的转录水平较高,其靶基因ARF3、ARF4在1.0 mg/L处的表达量最高,同时在2.0 mg/L时表达骤然降低。5龙眼TAS3基因转化Micro-Tom番茄及功能验证本试验利用酶切连接法将TAS3基因片段构建到植物表达载体pCAMBIA-1301上,并将其转化到农杆菌EHA105的感受态细胞中,进行Micro-Tom番茄的遗传转化。为验证转化结果对其进行PCR检测,试验结果显示,龙眼TAS3基因已成功转入到Micro-Tom番茄中；与对照组的普通Micro-Tom番茄相比,所获得转基因番茄植株的表型存在明显差异,主要表现在植株叶片的异常卷曲以及茎干和根部的粗壮。利用qPCR技术检测miR390、ARF3和ARF4在转基因番茄植株中的表达情况,结果表明：生长素响应基因ARF3、ARF4在转基因番茄中的表达水平都明显低于对照水平,推测转基因番茄植株中因TAS3基因的过量表达而强烈抑制了生长素响应因子的表达,与预期结果一致。此外,本研究也发现龙眼TAS3基因对植物的根、茎、叶的生长发育有着重要的影响。综上所述,龙眼小分子RNA准确地裂解其靶基因生长素响应因子而影响体胚的生长发育,即龙眼miR160负调控ARF10、ARF16、ARF17, miR167负调控ARF6、ARF8, miR390负调控TAS3, TAS3负调控ARF3、ARF4。除龙眼miR167初级体检测不到信号表达外,龙眼小分子RNA及其靶基因在龙眼“四季蜜”的花蕾、成花、叶片、小果、大果、果肉、果皮、种子和根9个不同组织器官中都有表达,且都在根部中有较高的转录水平。经PCR试验鉴定,在micro-Tom番茄中过表达龙眼TAS3基因并成功获得转基因植株,其根、茎、叶都发生明显的变化。因此,在龙眼体细胞胚胎发生过程中,小分子RNA与其靶基因生长素响应因子共同构成一个网络调控而影响植物的生长发育。