论文部分内容阅读
水产病毒对水产养殖业造成了重大的危害。目前关于水产病毒的研究报道有很多，但是有关水产病毒中重组病毒的研究却报道甚少。蛙虹彩病毒(Ranagryliovirus，RGV)是本实验室从患病的养殖沼泽绿牛蛙中分离得到的一种水产病毒，是一种能够导致养殖牛蛙高死亡率的病原体。本论文以RGV为研究对象，基于本实验室对RGV研究的基础上，进行重组蛙虹彩病毒研究以及利用重组病毒技术研究病毒基因的功能，主要结果如下:
1.含绿色荧光蛋白的重组蛙虹彩病毒的构建。本研究中，选择RGV的胸苷激酶基因TK和囊膜蛋白基因53R作为外源基因插入的靶位点，将绿色荧光蛋白(EGFP)基因与RGV主要衣壳蛋白的启动子p50结合，分别插入了RGV的TK和53R位点上。得到了两株能够表达绿色荧光蛋白的重组虹彩病毒，分别为△TK-RGV和△53R-RGV。这两株重组病毒感染细胞时，不仅能够形成空斑，而且在荧光显微镜下能够观察到绿色荧光，这为重组病毒的筛选和纯化提供了便利。重组病毒△TK-RGV经过七轮连续的挑斑筛选之后得以纯化，并且能够在鲤鱼上皮瘤(EPC)细胞中稳定增殖。纯化的△TK-RGV感染细胞时所形成的空斑都能够观察到绿色荧光。PCR显示△TK-RGV的结构是正确的，westernblotting表明EGFP蛋白确实在△TK-RGV感染的细胞中表达了。病毒一步生长曲线显示△TK-RGV和野生型RGV有相同的复制能力。电镜观察表明△TK-RGV的病毒粒子形态和野生型RGV无明显差别。然而，即使经过二十轮的挑斑筛选，重组病毒△53R-RGV也难以被纯化，说明外源基因的插入位点对重组病毒的构建和纯化是很重要的。以上结果表明RGV可作为外源基因表达的载体。
2.含乳糖操纵子的重组蛙虹彩病毒的构建。乳糖操纵子是研究的最为透彻的用于调控基因表达的系统。53R是蛙虹彩病毒的一个对病毒复制所必须的囊膜蛋白。在本研究中，我们选择53R基因作为靶基因，构建了一株含有乳糖操纵子和双荧光标记的重组蛙虹彩病毒i53R-RGV-lacIO。该病毒通过其产生的绿色和红色荧光筛选而得以纯化，病毒中53R表达水平可受IPTG的调控。i53R-RGV-lacIO是一株条件致死型的突变株，在有IPTG时与野生型RGV有相似的特征。然而，当没有IPTG时，53R的表达水平、病毒形成空斑的能力以及病毒的滴度都明显的降低了。同时，互补实验表明在体外过量表达53R能够提高病毒i53R-RGV-lacIO在无IPTG时的滴度，证明了i53R-RGV-lacIO在无IPTG时滴度的降低确实是由于53R被抑制所引起的。此外，电镜观察显示，在无IPTG时，i53R-RGV-lacIO产生的子代病毒粒子的数量显著的减少。以上的结果表明，重组虹彩病毒i53R-RGV-lacIO中的乳糖操纵子系统能够调节病毒基因的表达。本研究是含有乳糖操纵子的重组虹彩病毒的第一次报道，为水产病毒基因功能的研究提供了强有力的工具。
3.利用重组RGV研究囊膜蛋白2L的功能。病毒囊膜蛋白在病毒的感染过程中发挥了重要的作用。在本研究中，我们从蛙虹彩病毒中克隆了一个囊膜蛋白基因2L，并对其在病毒感染中可能的作用进行了分析。2L基因在所有已测序的虹彩病毒中都是保守的，其C端有一个连续的三重复序列和一个跨膜区。通过病毒成分提取和westernblotting显示，2L与病毒的膜成分相关。有趣的是，2L在转染细胞中的定位呈现为类似病毒加工厂的球状体。2L在转染细胞中能够与病毒另外的两个囊膜蛋白22R和53R共定位，说明它们之间可能存在相互作用。利用含有乳糖操纵子和双荧光标记的条件致死型重组病毒对2L的功能进行研究，结果表明2L对于病毒的感染是必须的。此外，中和实验显示，RGV的感染能够被鼠抗2L血清所抑制或者延迟，说明2L参与RGV的感染过程。以上的结果表明，2L与病毒其他的囊膜蛋白共定位，并且能够影响病毒的感染性。本研究为虹彩病毒基因功能分析提供了新的视野。