背景和目的:全球癌症死亡人数正在迅猛上升,癌症已成为我国五大致死性疾病之首,严重威胁着我国人民的健康水平。能量代谢的相对平衡是抑制肿瘤细胞过度生长的预防机制,而肿瘤细胞依靠代谢重组(如Warburg效应)获取能量,克服能量供应危机。因此,肿瘤细胞的能量代谢途径已成为肿瘤治疗的潜在靶点。细胞的能量代谢受多条信号通路的调控,其中单磷酸腺苷激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信号通路是最重要的途径,该通路参与调节Warburg效应,脂肪酸的合成与谷氨酰胺代谢,并与PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路以及多种转录因子有相互作用,共同调节细胞的增殖、生长、凋亡等细胞生物学行为,发挥抑癌作用。肿瘤发生早期,AMPKα1基因的缺失对癌基因诱发的肿瘤有促进作用,有临床病理资料显示肿瘤组织中AMPK活性低于正常组织,AMPK活性不足被认为是恶性肿瘤发生发展的原因之一。鉴于多种恶性肿瘤组织中AMPK的失活,众多学者探索如何利用化学或生物分子激活AMPK以抑制肿瘤生长,并取得良好的效果。例如,二甲双胍、AICAR、A769662、阿斯匹林、水杨酸,黄莲素等化学药物,其中关于降血糖药物二甲双胍的研究最为突出,现已作为抗癌辅助用药进入临床试验。除了化学药物,还发现一些细胞因子和应激压力也能激活AMPK。各种因素激活AMPK方式不尽相同,但AMPK的充分激活都有赖于AMPK激酶(AMPKK)的参与,目前已证实的AMPKK包括:LKB1、CaMKKβ、TAK1等。LKB1作为AMPK最重要的上游激酶,在各种肿瘤组织中表达不一,对二甲双胍等AMPK激活剂的抗癌效果有重要影响,但目前对于LKB1在应激压力激活AMPK的作用尚不清楚。此外,我们的前期研究还发现某些应激压力(细胞因子刺激或化疗药物)激活AMPK的过程中,并未涉及以上AMPKK。例如,可诱导渗透压改变的山梨醇。这些应激压力不仅诱导肿瘤细胞的凋亡,还可以引起AMPK活化,但其具体机制尚不清楚。由此可见,为了提高肿瘤细胞中AMPK的活性,不仅有必要对LKB1-AMPK途径进行深入研究,还要探索其他的AMPK激活途径及其在抗肿瘤治疗的作用。因此,我们进行了以下研究:⑴胃癌及肺癌组织中的p-ampk和lkb1的表达情况;⑵lkb1过表达对胃癌细胞sgc-7901生物学行为的影响;⑶atm和lkb1在抗癌药物依托泊苷激活ampk中的作用;⑷ampk活化是否增加肿瘤细胞对依托泊苷的药物敏感性;⑸lkb1和mlk3对ampk的调节作用。材料与方法:1.本课题的临床标本来自南昌大学第一附属医院手术切除标本(伦理批准号2014〔025〕),收集60例胃癌及其对应癌旁组织,采用免疫组化染色分析检测胃癌及癌旁组织p-ampk(thr172)及lkb1的表达水平;另外,收集了65例不同阶段的肺腺癌标本,采用免疫组化染色分析不同阶段的肺腺癌组织p-ampk(thr172)表达水平;2.在缺乏lkb1蛋白的sgc-7901细胞株中转入功能性野生型lkb1基因,构建稳定表达lkb1的细胞株。以mtt法检测细胞生长和存活,以细胞划痕实验检测细胞迁移,以流式细胞技术检测细胞周期、cd44阳性表达细胞比例、细胞凋亡比率;3.依托泊苷以浓度依赖或时间依赖的方式作用于前列腺癌细胞c4-2后,收集蛋白,以免疫印迹法检测ampk、atm磷酸化水平;另外,sirna干扰c4-2细胞中的atm或lkb1,再给依托泊苷刺激后,检测ampk、atm的磷酸化水平。4.转入ampkdn突变体到c4-2细胞抑制ampk活化(c4-2dn),以空载体为对照(c4-2e),给依托泊苷刺激24小时,以流式细胞仪检测细胞凋亡情况;选择ampk活性不同(c4-2dn及c4-2e)细胞和lkb1表达不同(a549e及a549-lkb1)的细胞,给予依托泊苷刺激不同时间后,以免疫印迹法检测凋亡蛋白表达(cleavedcaspase3cleavedparp)。5.选择lkb1表达不同(a549及a549-lkb1)细胞,给予各种应激因子刺激后,以免疫印迹技术检测p-ampk与p-jnk,筛选出同时激活ampk与jnk的因子;在hek-293t细胞中转入mlk3质粒,后检测ampk的磷酸化水平;以gsh纯化技术,获得基因重组蛋白mlk3和ampk,以体外酶学实验检测mlk3对ampk的磷酸化;在hek-293t细胞中,转入mlk3质粒后,用gshbeads将gst-mlk3蛋白捕获,以免疫印迹检测沉淀中是否捕获内源性ampkα1或ampkα2蛋白;将myc-ampk?1或?2和gst-mlk3质粒共转染hek-293t细胞,收集细胞裂解液,与gshbeads孵育,离心沉淀,收集gshbeads-mlk3和捕获的蛋白,以anti-gst和anti-myc抗体进行免疫印迹分析。结果1.胃癌及肺癌组织中ampk和lkb1情况。⑴免疫组化结果显示胃癌组织p-ampk(thr172)、lkb1的表达低于癌旁组织(p<0.001)。p-ampk(thr172)表达:胃癌中(-)20例,(+)33例,(++)6例,(+++)1例,而癌旁组织中:(-)5例,(+)11例,(++)28例,(+++)16例。lkb1表达:胃癌中(-)23例,(+)25例,(++)12例,(+++)0例,癌旁组织中lkb1表达:(-)9例,(+)13例,(++)27,(+++)11例。⑵不同分期肺癌组织中的ampk活化情况,随着肺腺癌分期的恶性程度增高,p-ampk(thr172)表达渐渐下降,Ⅰ期>Ⅱ期>Ⅲ期(spearman相关分析=-0.397,p<0.05)。Ⅰ期(-)4例,Ⅰ期(+)5例,Ⅰ期(++)10例,Ⅰ期(+++)3例;Ⅱ期(-)5例,Ⅱ期(+)10例,Ⅱ期(++)9例,Ⅱ期(+++)3例;Ⅲ期(-)9例,Ⅲ期(+)8例,Ⅲ期(++)1例,Ⅲ期(+++)0例。2.提高lkb1蛋白表达对胃癌细胞sgc-7901生物学行为的影响在缺乏lkb1的肿瘤细胞sgc-7901中转入lkb1基因,增加lkb1的表达可以抑制细胞的增殖与迁移,减少cd44阳性细胞的比例,提高肿瘤细胞对奥沙利铂、5-氟尿嘧啶和伊立替康三种抗癌药物敏感性。3.atm和lkb1在依托泊苷激活ampk中的作用⑴westernblot结果显示:肿瘤细胞a549受依托泊苷刺激后,p-atm和p-ampk(thr172)逐渐上升,并呈剂量和时间依赖性;⑵sirna干扰c4-2细胞的atm表达后,atm表达下调,给予依托泊苷刺激细胞,westernblot结果显示:p-atm和p-ampk(thr172)无明显上升;而对照组atm表达正常,提示依托泊苷刺激可以同时激活atm和ampk,依托泊苷激活ampk过程中需要atm的参与。⑶sirna干扰c4-2细胞的lkb1表达,lkb1表达下降,给予依托泊苷刺激细胞,westernblot结果显示:p-atm表达逐渐上升,而无法激活ampk;而对照组lkb1表达正常,依托泊苷刺激可以同时激活atm和ampk。提示在缺乏lkb1的条件下,依托泊苷可以激活atm,但无法激活ampk。⑷在缺乏lkb1的a549细胞中,转入lkb1基因,提高lkb1蛋白表达后,给予依托泊苷刺激细胞,westernblot结果显示:可以同时激活atm和ampk;而对照组lkb1表达无变化,依托泊苷刺激p-atm表达逐渐上升,而无法激活ampk。以上结果提示:依托泊苷激活ampk过程中需要atm和lkb1共同参与。4.ampk活化对肿瘤细胞药物敏感性的影响⑴流式细胞分析显示,在依托泊苷刺激下c4-2e细胞(ampk有活性)凋亡细胞的比例明显高于c4-2dn(ampk无活性);⑵依托泊苷刺激后,c4-2e细胞中的p-ampk(thr172)表达、cleavedcaspase3表达和cleavedparp表达明显高于c4-2dn细胞;⑶依托泊苷刺激下,a549-lkb1细胞的p-ampk(thr172)表达、cleavedcaspase3表达和cleavedparp表达明显高于对照组(a549e)。结果提示,ampk活化或提高lkb1表达有助于增强肿瘤细胞的药物敏感性。5.mlk3对ampk的调节作用⑴a549-lkb1和a549-wt细胞受山梨醇、aicar等7种因子刺激,仅在山梨醇所刺激a549-lkb1和a549-wt两种细胞后,p-ampk和p-jnk都升高;提示山梨醇可以同时激活ampk和jnk,并不依赖于lkb1。⑵a549-lkb1和a549-wt细胞受山梨醇刺激,两细胞的p-ampk同时升高,提示山梨醇可能以不依赖lkb1的方式激活ampk;⑶在hek293t细胞中转入mlk3质粒,过表达mlk3蛋白,然后以免疫印迹法检测p-ampk(thr172)水平,结果显示mlk3的异常过表达可提高p-ampk(thr172)水平。⑷体外激活ampk酶学实验显示,单独加入amp或单独加入lkb1蛋白对ampk的磷酸化无明显影响;同时加入amp和lkb1可以引起ampk的磷酸化;单独加入mlk3可以引起明显的ampk磷酸化;同时加入amp和mlk3引起的ampk磷酸化最强。该结果提示mlk3可在缺乏amp的情况下磷酸化ampk,说明ampk是mlk3的催化底物。⑸MLK3与AMPK间的相互结合;通过Pulldown技术发现,转入GST-MLK3质粒的细胞提取物中发现AMPKα1的表达,提示转入表达的MLK3蛋白与细胞内源性AMPKα1亚单位紧密结合;共转染Myc-AMPK?1或?2和GST-MLK3入HEK-293T细胞,然后通过IP技术证明,外源性表达GST-MLK3蛋白能与外源性Myc-AMPK?1蛋白发生特异性结合。结论:1.癌组织中AMPK失活可能是恶性肿瘤发生发展的原因之一,LKB1表达下调可使AMPK失活。在缺乏LKB1表达的肿瘤细胞中,提高LKB1蛋白表达可以抑制细胞的生长、转发移,增强肿瘤细胞的药物敏感性。2.依托泊苷激活AMPK的过程需要ATM和LKB1共同参与;AMPK活化使得肿瘤细胞对依托泊苷诱导凋亡作用更为敏感。3.MLK3能与AMPK?1结合,并以非LKB1方式直接磷酸化AMPK,MLK3有可能是AMPK新的上游激酶。