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第一部分P53、MDM2及TRIM25在AD中主动脉中层的表达和意义目的:探讨主动脉中层中α-SMA、OPN、P53、MDM2和TRIM25蛋白在AD中的表达变化。方法:将12名A型AD手术患者的升主动脉作为实验组,12名DCD供体的升主动脉作为对照组。用免疫组化和western blot检测α-SMA、OPN、P53、MDM2、TRIM25和p-P53在AD组及对照组组织中的表达情况,用RT-PCR技术检测AD组及对照组组织中P53、MDM2及TRIM-25mRNA含量。HE染色和masson染色观察主动脉组织的形态学变化。结果:通过western blot和RT-PCR检查我们发现P53、MDM2和TRIM-25的蛋白、mRNA含量在AD组织中明显增加,免疫组化检测也表明P53、MDM2和TRIM25含量增加,但其p-P53水平却下降。免疫组化结果显示α-SMA阳性细胞在AD组中的含量较对照组显著减少,而OPN阳性细胞在AD组增高,进一步western blot检测也证实了这一变化。HE染色和masson染色显示AD组中弹力纤维断裂和胶原纤维沉积明显增多,VSMC数量减少。结论:AD主动脉中层中VSMC表型向去分化型转变,而P53、MDM2、TRIM25的表达量增高,提示TRIM25可能通过影响P53/MDM2反馈环而导致VSMC表型转变参与AD形成。第二部分TRIM25过表达对VSMC功能和P53/MDM2反馈环的影响目的:探讨VSMC中过表达TRIM25后P53、MDM2含量变化及其对VSMC功能的影响。方法:构建TRIM25慢病毒质粒,测定病毒滴度后感染小鼠主动脉血管平滑肌细胞VSMC,分为TRIM25过表达组、空载对照组和正常对照组。Western blot检测各组 VSMC 中α-SMA、OPN、P53、MDM2、TRIM-25、p-P53、PCNA蛋白含量,RT-PCR检测P53、MDM2、TRIM-25的mRNA含量。MTT法检测各组VSMC的增殖情况,Transwell法检测VSMC的迁移情况,流式细胞术检测凋亡情况。免疫荧光染色比较α-SMA、OPN含量变化。结果:相比于正常对照组和空载对照组,TRIM25过表达组的P53、MDM2、TRIM-25、PCNA和BAX蛋白表达增加,p-P53表达下降,而P53/MDM2 mRNA水平无显著差异。Western blot发现TRIM25过表达组的OPN的蛋白表达增加,而α-SMA表达减少,免疫荧光染色也证实OPN增加而α-SMA减少。MTT和Transwell实验提示TRIM25组VSMC增殖迁移能力增加,流式细胞术检测其凋亡也增加。结论:TRIM25过表达后VSMC表型向去分化型转变,增殖迁移能力增强,凋亡水平升高,其可能机制是TRIM25破坏了 VSMC的P53/MDM2负反馈环平衡,导致P53、MDM2蛋白表达增加而活性降低。第三部分MDM2阻断剂Nutlin-3a对TRIM25过表达后VSMC功能及P53/MDM2反馈环的影响目的:使用MDM2阻断剂Nutlin3a干预P53/MDM2反馈环后再探讨TRIM25过表达对VSMC功能的影响。方法:小鼠主动脉血管平滑肌细胞分为四组:TRIM25质粒组(过表达TRIM25慢病毒质粒转染VSMC)、TRIM25质粒转染+Nutlin3a干扰组(Nutlin3a处理后再TRIM25慢病毒质粒转染)、Nutlin3a干扰组(单纯Nutlin3a处理)和正常对照组,Western blot法检测各组VSMC中α-SMA、OPN、P53、MDM2、TRIM-25、p-P53、PCNA 及 BAX 蛋白含量,用 RT-PCR技术检测 P53、MDM2、TRIM-25的mRNA含量。MTT法测各组VSMC的增殖情况,Transwell法检测VSMC的迁移情况,流式细胞术检测凋亡情况。结果:TRIM25+Nutlin3a组、Nutlin3a组的P53、p-P53量含量较正常组均显著增加,而MDM2蛋白表达减少,P53表达量较TRIM25转染组增加,但差异无统计学意义。细胞中P53和MDM2的mRNA水平较正常组升高。Western blot检测发现TRIM25+Nutlin3a组和Nutlin3a组的α-SMA表达量较TRIM25组和正常组均增加,而OPN表达量显著下降。而TRIM25+Nutlin3a组和Nutlin3a组相比差异无统计学意义。MTT和Transwell实验提示TRIM25+Nutlin3a组和Nutlin3a组VSMC增殖迁移能力下降,流式细胞术检测干预细胞组凋亡率均增加而TRIM25+Nutlin3a组凋亡率最高。结论:Nutlin3a阻断MDM2后VSMC表型向分化型转变,增殖迁移能力减弱,凋亡水平显著升高,即使同时过表达TRIM25也不能逆转。结合第二部分结果说明TRIM25主要是通过影响P53/MDM2负反馈环平衡来调控VSMC表型转化和功能变化,其可能机制是TRIM25竞争性抑制P53单或多聚泛素化。