百合体细胞胚的诱导及悬浮培养的研究

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:f415931981
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在植物遗传转化体系的研究中,首要条件是建立良好的遗传转化受体系统。使用体细胞胚途径建立的再生体系由于再生率高、嵌合体少、变异小等优点,被认为是遗传转化的理想受体材料。在百合诱导体细胞胚进行遗传转化的报道中,诱导体细胞胚的条件高、材料来源单一、增殖慢,转化率低,并且已有的研究都集中于麝香百合和新铁炮百合。因此,本实验研究了适于进行蓝色花分子育种的OT杂种百合‘罗宾娜’(Liliumtenuifolium oriental x tumpet ‘Robina’)的体细胞胚途径的再生体系,对不同外植体诱导胚性愈伤组织的所需的激素进行了探讨,测定了液体培养基对愈伤组织继代增殖的影响,采用农杆菌介导进行了GUS基因的瞬时表达研究。主要结果如下:(1)以OT杂种百合‘罗宾娜’鳞茎鳞片、花丝、子房和茎轴、花梗等为外植体进行了胚性愈伤组织诱导。鳞茎鳞片和花丝外植体在培养基MS+Picloram1.0mg·L-1上诱导率最高,分别为36.60%和40.01%,而子房外植体在MS+Picloram1.5mg·L-1上诱导率最高,为47.20%。茎轴外植体在培养基MS+NAA2.2mg·L-1+TDZ0.1mg·L-1上诱导率则高达89.20%。在鳞茎鳞片、花丝、花梗和花药使用NAA,2,4-D和6-BA组合间接诱导愈伤组织过程中,最适外植体为鳞茎鳞片,在MS+NAA1.0mg L-1+2,4-D0.5mg L-1+6-BA0.1mg L-1培养基上的分化率最高,为54.54%,从不定芽基部形成愈伤组织的最适培养基为MS+NAA0.5mg·L-1,诱导率为71.17%。三种不同激素诱导的愈伤组织再生率都为100%。(2)Picloram和NAA与TDZ组合诱导的愈伤组织在液体培养过程中都不易分散,其中Picloram诱导的三种外植体的愈伤组织培养1个月后可建立起由1~3mm的细胞团构成的悬浮系,以花丝愈伤组织建立的悬浮系增殖最快,再生率也最高,为79.74%。NAA与TDZ对茎轴诱导的愈伤组织45天后建立起由2~5mm的细胞团构成的悬浮系,NAA与TDZ对茎轴诱导愈伤组织的悬浮系的再生率高于Picloram诱导愈伤组织的悬浮系,为86.94%。在NAA0.5mg·L-1的培养基上由不定芽芽基部形成的愈伤组织以经过液体预培养后在固体上培养的方式继代,繁殖速率最大,该愈伤组织的液体培养与前两者不同,其培养液中无游离细胞出现,而是接种愈伤块的个体膨大增殖,并且再生率与固体培养的再生率相同。(3)使用农杆菌介导转化pCAMBIA1301质粒后,Picloram诱导花丝产生愈伤组织的悬浮物侵染时的最佳侵染时间分别和10min,Picloram诱导花丝产生的悬浮物的GUS瞬时表达效率为26.8/100mg愈伤组织(蓝色斑点数)。NAA与TDZ组合诱导茎轴产生愈伤组织的悬浮物为8min,NAA与TDZ组合诱导的悬浮物的GUS瞬时表达效率为28.3/100mg愈伤组织。使用NAA分别经固体培养、液体培养和液体预培养后再固体培养三种不同方式继代培养的愈伤组织,侵染时确定的最佳侵染时间为10min,它们的GUS瞬时表达效率差异并不显著。
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