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第一部分神经营养因子衍生肽治疗母体对子代AD小鼠的影响目的目前尚缺乏有效的治疗阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)患者的药物,临床上使用的4种AD治疗药物的作用仅限于缓解临床症状。因此,找到真正有效的治疗方法迫在眉睫。Dr.Iqbal实验室之前的研究发现,给3×Tg-AD小鼠长期口服神经营养因子衍生肽P021不仅能改善其神经再生成、神经元和突触的可塑性,还延缓了疾病的发展。本课题旨在研究给予亲代3×Tg-AD小鼠神经营养因子衍生肽P021,以观察子代小鼠的疾病发生发展是否得到延缓,探讨P021是否对子代小鼠学习记忆功能的障碍、tau的磷酸化水平增加和突触可塑性降低有预防作用。方法1.从胎龄第八天起以含神经营养因子衍生肽P021(200nmol/g)的饲料喂养野生型(wild type,WT)和3×Tg-AD亲代母鼠至子代断奶,之后换成一般饲料。2.子代小鼠2.5个月时进行行为学试验(高架十字迷宫试验、旷场试验、新物体识别试验、水迷宫试验、转杆试验、条件恐惧性试验)。3.子代小鼠4个月时被处死,取海马,利用Western blot分析tau的磷酸化和一些蛋白的表达。结果1.高架十字迷宫试验结果显示,WT小鼠进入开臂的次数较3×Tg-AD小鼠少,在开臂上的时间短于3×Tg-AD小鼠,P021对两种小鼠均未产生影响。2.旷场试验结果显示,3×Tg-AD小鼠在旷场中间区域逗留的时间少于WT小鼠,P021对两种小鼠均未产生影响。3.新物体识别试验结果显示,WT小鼠与3×Tg-AD小鼠探索新物体的时间无显著性差别,而P021饲料喂养的3×Tg-AD小鼠子代的探索时间比喂养正常饲料的小鼠子代显著增加。4.水迷宫试验结果显示,3×Tg-AD小鼠在原来放有逃生平台的象限逗留的时间比WT小鼠明显减少,P021有修复这种损伤的趋势,但未达到显著水平。5.转杆试验结果表明,3×Tg-AD小鼠停留在转杆上的时间长于WT小鼠,P021未影响小鼠的运动功能。6.条件恐惧性试验结果显示,3×Tg-AD小鼠僵直的时间比WT小鼠长,P021没有产生影响,但此结果可能是由于3×Tg-AD小鼠的移动频率较低造成的。7.Western blot结果表明,经P021喂养的3×Tg-AD小鼠子代,BDNF的成熟增强;tau蛋白的Ser396、Ser404、Thr212位点磷酸化下降;Ser199、Ser202位点的磷酸化没有变化;GSK-3β的Ser9位点磷酸化有上升趋势、CREB(Ser133)的磷酸化水平没有变化;Glu R1水平上升、PSD95和Neu N有上升趋势、而synaptophysin没有变化。结论1.经P021喂养过的3×Tg-AD小鼠子代,短期记忆得到显著性改善,但焦虑程度、运动行为、空间记忆、条件性记忆未发生显著性变化。2.P021不仅改善了3×Tg-AD小鼠的神经元生成和突触可塑性的损伤以及认知功能,还抑制了其潜在的病理过程。第二部分小鼠死后磷蛋白磷酸化的变化及其生物学意义目的蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活性和功能的最基本、最普遍,也是最重要的机制。本研究旨在了解动物死亡后磷蛋白磷酸化水平的变化,揭示机体蛋白质磷酸化的真实水平,阐明其生理学、病理学作用。方法1.为了研究动物死亡后磷蛋白磷酸化变化的进程,将小鼠脱颈椎处死后,在4oC放置2、5、10分钟,而后取脑,用Western blot分析多种磷蛋白的磷酸化水平。2.为了了解小鼠死后蛋白去磷酸化速度,我们记录取材时间,利用Western blot分析,将磷酸化水平和取材时间做非线性回归计算。3.将小鼠脱颈椎处死后,在4oC放置2、5、10分钟,而后取心脏、肺、肾,利用western blot分析多种蛋白的磷酸化水平。4.模拟常规的灌注过程,分别采用室温和冷(约0至4摄氏度)的PBS溶液进行灌注,利用Western blot分析脑组织蛋白磷酸化是否发生变化及其是否受灌注液温度的影响。5.将小鼠脱颈椎处死后,立即取脑,随后将脑浸泡在冰冷的PBS(0oC)溶液中2、5、10分钟,利用Western blot分析低温是否能防止脑蛋白磷酸化变化。结果1.小鼠死亡后tau蛋白在Thr212、Thr205、Ser396、Ser214、Ser262这些位点发生了显著的去磷酸化,其中,Thr212、Ser262最为敏感,小鼠死后两分钟就几乎检测不到它们的磷酸化,而Ser199、Ser404、Ser422的去磷酸化最为缓慢。AKT(Ser473)、GSK-3β(Ser9)、CREB(Ser133)、Erk(Thr202/Tyr 204)发生快速去磷酸化,AMPK(Thr172)和PKAc(Thr197)的磷酸化在死亡后随着时间的增加而上升。2.tau蛋白的Ser199位点在小鼠死后200s内没有发生显著性变化,tau蛋白的p T212及GSK-3β(Ser9)的磷酸化水平在40s内下降了近一半,tau蛋白的Thr205,Ser396位点、CREB(Ser 133)磷酸化也下降,但没有那么迅速。3.心脏、肺、肾的GSK-3β(Ser9)、CREB(Ser133)磷酸化显著下降。然而AMPK(Thr172)和PKAc(Thr197)没有发生显著性变化。4.无论是用室温还是冷的PBS进行灌注,tau蛋白的Ser199、Thr205、Thr212、Ser214、Ser262、Ser396位点,AKT(Ser473)、GSK-3β(Ser9)、CREB(Ser133)、Erk(Thr 202/Tyr 204)都发生了去磷酸化。但使用冷PBS灌注,这些蛋白的去磷酸化程度小于使用室温PBS。AMPK(Thr172)和PKAc(Thr197)的磷酸化水平上升,并且冷的PBS灌注使得PKAc(Thr197)磷酸化水平上升更显著。5.低温可以有效地防止磷酸化水平的变化,并且浸泡在冰冷的PBS(0oC)溶液中2-5分钟有效地阻止蛋白质的磷酸化改变。结论小鼠死后多种蛋白磷酸化水平发生变化,其变化具有组织、蛋白及位点的特异性。将脑组织迅速浸泡在冰PBS中能有效地避免蛋白质磷酸化的改变。对于与磷酸化相关的研究,应避免进行灌注。