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疟疾仍然是世界上严重危害人类健康的传染病。全球大约有40%的人口面临感染疟疾的危险,每年大约有1～3亿的新发疟疾病例,其中死亡人数在100～200万左右。疟疾是由按蚊的叮咬传播的。按蚊叮刺时将疟原虫子孢子注入宿主体内,随后子孢子进入血液循环,并可在数分钟后迅速侵入肝细胞。经短暂的红外期增殖发育,裂殖子再次进入血液循环、侵入红细胞导致疟疾临床发作。疫苗是疟疾防治的重要手段之一。虽然,疟原虫红外期感染不会引起患者出现临床表现,但是,阻断红外期疟原虫的发育可以防止红内期疟原虫的发育;另外,红外期休眠子的存在也是间日疟原虫患者复发的重要原因,因此,疟原虫红外期能从源头控制疟原虫的感染和防止疟疾的复发,是设计疟疾亚单位疫苗的理想时期。迄今为止,最有保护性的红外期疫苗是减毒子孢子疫苗,它能为宿主提供相对持久的保护性免疫。由于子孢子需要在蚊体内发育,而且子孢子的减毒的程度不易控制,因此限制了减毒子孢子疫苗在实际中的应用。然而,鉴于减毒子孢子疫苗能诱发持久的保护性免疫,因此被作为研究有效肝期疫苗和筛选疫苗及候选抗原的重要模型。本研究建立了约氏疟原虫265株减毒子孢子疫苗诱导小鼠产生完全保护性免疫小鼠模型,并初步探讨了减毒子孢子疫苗的保护性效应机制,为深入研究红外期疫苗的保护性免疫机制和疟疾亚单位疫苗的研制奠定了重要的基础。一、构建Real-time PCR红外期疟原虫检测平台:比对已知不同种属疟原虫的A型18S rRNA的核苷酸序列,根据保守核苷酸序列设计疟原虫特异的18S rRNA引物,PCR扩增获得长度约为839bp的目的片段。常规T/A克隆获得P.y. BY265株18S rRNA序列,与约氏疟原虫17XNL株相似性为98%。根据P.y. BY265株18S rRNA序列设计特异Real-time PCR引物和TaqMan探针,以小鼠GAPDH为内参照,构建P.y. BY265红外期疟原虫Real-time PCR检测平台,结果显示,构建的Real-time PCR检测平台能够检测到最低为50个子孢子剂量感染的小鼠肝脏虫荷。二、减毒子孢子诱导免疫小鼠产生保护性免疫及其效应机制:1、确定减毒子孢子辐照减毒最适合的剂量:采用8000rd和10000rd剂量的60Co室温照射减毒约氏疟原虫BY265株子孢子80 min后,以10000个/次尾静脉注入小鼠,部分小鼠在疟原虫感染后42h取出肝脏进行Real-time PCR分析,部分小鼠在疟原虫感染后4~14天内进行原虫血症检查。结果显示,8000rd辐照组感染小鼠能检测到疟原虫特异的18sUrRNA,而10000rd辐照组感染小鼠未能检测到疟原虫特异的18sUrRNA;一直到感染后14天,两组感染小鼠均未检测到红内期疟原虫,因此,8,000rd应该是比较合适的子孢子减毒辐照剂量。2、减毒子孢子免疫诱导小鼠产生完全保护性免疫:末次免疫后14天,尾静脉注射1,000个野生株子孢子攻击感染减毒子孢子免疫小鼠和对照小鼠,攻击后5～14天,吉氏染色常规检测疟原虫红内期,发现正常对照组小鼠在第5天出现原虫血症,第14天时原虫血症达到10%以上;然而,减毒子孢子免疫小鼠在攻击后14天均未查见红内期疟原虫,说明减毒子孢子免疫能诱导小鼠产生完全保护性免疫。3、减毒子孢子免疫的保护性效应机制的初探:末次免疫后30天,收集对照组小鼠和减毒子孢子免疫小鼠血清,采用间接免疫荧光实验检测血清中抗子孢子特异抗体的滴度。结果显示,2只减毒子孢子免疫小鼠血清的抗子孢子抗体滴度分别为1∶200和1∶4 00;然而,正常对照组小鼠血清在1∶1 0稀释度时无任何荧光反应,而减毒子孢子免疫小鼠血清均可与约氏疟原虫BY265株子孢子发生特异荧光结合反应,且荧光点数量、亮度随血清稀释度增加而减少,提示减毒子孢子疫苗能诱导小鼠产生子孢子特异抗体。末次免疫后45天,分离对照组和减毒子孢子免疫小鼠的肝脏淋巴细胞,CSP CD8+ T细胞表位多肽SYVPSAEQ刺激18h后,检测IFN-γ的分泌情况,发现CSP CD8+ T细胞表位多肽能有效的刺激免疫小鼠肝脏淋巴细胞产生特异性的CTL细胞,分泌大量的IFN-γ,接近阳性对照水平,而阴性对照不能分泌IFN-γ,提示减毒子孢子疫苗能诱导小鼠产生CSP特异的CD8+ T细胞。总之,本课题通过建立有效的红外期疟原虫定量检测平台和约氏疟原虫BY265株减毒子孢子小鼠模型,确定了减毒子孢子辐照减毒最适合的剂量,发现减毒子孢子对小鼠产生了有效的保护性免疫,可能与其能诱导子孢子特异抗体和CSP特异的CD8+T细胞有关。