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目的:研究腺病毒介导的脂联素(APN)过表达对(1)Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化(AS)的抑制作用和对NF-κB信号通路及其下游因子表达的影响;(2)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)AS样损伤、NF-κB p65核蛋白及其信号通路下游炎症因子的负性调控作用。方法:(1)腺病毒介导的APN过表达对Apo E-/-小鼠动物的安全性检测:将48只常规饮食饲养的12周龄雄性Apo E-/-小鼠分为对照组和脂联素干预组,每组24只。对照组给予一次性尾静脉注射生理盐水100μl;干预组则同法注射等量腺病毒脂联素载体(Ad-APN-e GFP,3.0×108p.f.u)。分别在注射后0天、1周、2周、及4周处死小鼠,取全血和主动脉血管组织。用ELISA测定血清中APN浓度;用Western blot法检测血管组织中标识绿色荧光蛋白(GFP)以确定重组腺病毒的转染率。用全自动生化仪检测血常规指标、心肌酶、尿素氮(BUN)以确定重组腺病毒转染的安全性。(2)腺病毒介导的APN过表达对Apo E-/-小鼠AS的抑制作用:将12周龄雄性Apo E-/-小鼠120只分为空载腺病毒对照组和脂联素干预组,每组60只。两组小鼠均给于高脂饮食诱发AS。分别在高脂饮食开始后0天、2周、4周、及6周时给予一次尾静脉注射100μl腺病毒空载载体(Ad-e GFP,3.0×108p.f.u)或腺病毒脂联素载体(Ad-APN-e GFP,3.0×108p.f.u)。在3个不同时间点(0天、4周、8周)处死受试小鼠,取全血和主动脉血管组织。用全自动生化仪检测血脂指标总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的浓度;ELISA法测定血清APN和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)浓度;比色法测定超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)浓度。用油红O染色法检测动脉血管总体的斑块损伤百分比;HE染色法检测小鼠主动脉血管组织的病理学变化;Masson染色法检测进展性斑块区的胶原含量和纤维帽厚度变化;免疫组化法检测血管巨噬细胞(MAC)和平滑肌细胞(SMC)的比例变化;实时荧光定量法测定小鼠主动脉组织APN、一氧化氮合酶(e NOS)、白介素-10(IL-10)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的m RNA表达;免疫荧光法测定小鼠主动脉血管APN和NF-κB p65蛋白的表达;免疫印迹法检测主动脉血管NF-κB p65核蛋白和NF-κB下游因子的表达。(3)腺病毒介导的APN过表达对用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的体外培养的HUVEC AS样损伤的干预。实验分四组:正常对照组(细胞常规培养,未用ox-LDL诱导);ox-LDL诱导组(用30μg/ml的ox-LDL诱导细胞48h);PDTC干预+ox-LDL诱导组(先用100μmol/l的PDTC处理细胞1h,再用ox-LDL30μg/ml诱导48h);Ad-APN-e GFP干预+ox-LDL诱导组(以MOI=100p.f.u/cell转染HUVEC细胞2h后,用ox-LDL 30μg/ml诱导48h)。收集各组细胞用CCK-8比色法分析Ad-APN-e GFP转染对HUVEC增殖活性的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡;ELISA法检测HUVEC培养上清液中炎症因子ICAM-1、VCAM-1、MCP-1及抗炎因子e NOS的表达;实时荧光定量法测定HUVEC中e NOS、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1的m RNA表达;Western blot法检测e NOS、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、APN和NF-κB p65核蛋白的表达。结果:(1)腺病毒对血常规指标和心肌酶的表达没有显著影响,对肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)(1周时组间差异P<0.01和2周时组间差异P<0.05)、肾功能指标尿素氮BUN(1周时组间差异P<0.01)有一过性影响。r Ad-APN-e GFP载体可在体内高效介导外源基因APN的表达,血清中的APN浓度在病毒转染后1周达到了最高值,约是正常对照组的4倍(78.28±15.02 vs 23.42±5.35)μg/ml,2周内稳定表达。1周时GFP蛋白在血管组织中表达的量最高,1周时GFP/GAPDH为83.63±1.50%,随后逐渐降低,2周时GFP/GAPDH为54.00±4.00%,4周时GFP/GAPDH为22.00±3.99%。(2)APN过表达抑制了Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成。与对照组相比,脂联素干预组的动脉粥样硬化病理损伤面积明显减少(P<0.01),斑块损伤面积4周时为1.35±0.17 vs 1.50±0.74(×104μm2),8周时为1.70±0.34 vs 2.21±0.28(×104μm2);斑块所占管腔比率显著下降(P<0.001),4周时为28.36±3.22 vs 35.61±7.43(%),8周时为38.25±6.30 vs 56.89±6.21(%);动脉粥样硬化损伤程度明显降低(P<0.001),总体油红O染色测定血管表面损伤百分比,4周时为27.78±8.64 vs 33.02±5.18(%);8周时为31.58±5.87 vs 52.16±5.79(%)。脂联素减缓了高脂饮食导致的小鼠血清中TC(P<0.001)、TG(P<0.001)、LDL-C(P<0.001)的浓度增加,使血脂水平趋向正常化,减缓了小鼠的体重增长(P<0.05)。随着血清脂联素浓度增加,Apo E-/-小鼠整体的炎性状态减轻,MMP-9的水平显著降低(P<0.05),4周时为50.23±14.24 vs51.33±15.66(ng/ml),8周时为55.99±11.74 vs 80.50±14.54(ng/ml);SOD活性显著增加(P<0.05),MDA水平显著降低(P<0.001),氧化应激程度降低。外源性的脂联素上调抗炎因子e NOS(P<0.05)和IL-10(P<0.001)的m RNA基因表达,降低炎性因子TNF-α(P<0.001)、IL-6(P<0.001)、VCAM-1(P<0.05)的基因表达。脂联素可以阻遏NF-κB通路的激活,抑制NF-κB p65核蛋白表达(P<0.001)。(3)r Ad-APN-e GFP可以高效、稳定地转染人脐静脉内皮细胞,r Ad-APN-e GFP对人脐静脉内皮细胞的转染效率在转染复数MOI=100 p.f.u/cell,转染48h时达到高峰85.03±6.77%,至转染后72h,e GFP在HUVEC细胞仍处于高表达84.26±7.16%。ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞造成内皮细胞体外损伤模型,激活NF-κB信号通路,NF-κB p65核蛋白的表达量显著增加(P<0.001)。r Ad-APN-e GFP转染能够抑制NF-κB通路的激活,使NF-κB p65核蛋白表达量显著降低(P<0.001)。降低NF-κB调节的下游炎症分子VCAM-1、ICAM-1、MCP-1的基因和蛋白表达(P<0.001),增加抗炎因子e NOS的基因和蛋白表达(P<0.001)。Ad-APN-e GFP和NF-κB抑制剂PDTC干预抑制内皮细胞损伤的作用基本一致,没有显著差异(P>0.05)。结论:(1)腺病毒注射存在一过性的肝毒性和肾毒性,但是对动物的生理状态没有显著影响。r Ad-APN-e GFP对Apo E-/-小鼠的血管组织有高效转染、2周内安全、稳定表达的特性。(2)脂联素过表达对Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化具有显著的保护作用,减轻模型整体的炎性水平。抑制NF-κB通路的激活,NF-κB p65核蛋白表达和NF-κB下游炎症因子的表达,上调抗炎因子的表达,说明脂联素通过抑制NF-κB通路激活来减轻AS这种炎症反应;(3)r Ad-APN-e GFP载体可高效、稳定地转染HUVEC,有效抑制ox-LDL诱导HUVEC的NF-κB激活,减轻ox-LDL诱导的细胞炎性损伤和细胞凋亡,与使用PDTC干预具有相近的效果。证实r Ad-APN-e GFP和PDTC一样是通过抑制NF-κB通路的激活来减轻AS这种炎症反应。