论文部分内容阅读
哈维氏弧菌隶属于弧菌科中的弧菌属,主要感染虾及鱼类,在海洋环境中分布范围很广,是海水中一种常见的病原菌,主要存在于自由水体、浮游动植物体表、海底沉积物中。本研究中的磷脂酶D（phospholipase D,PLD）来源于致病菌哈维氏弧菌,通过同源建模发现它具有不同于其他PLD的独特的结构—C-末端突出一段肽链,且C-末端和N-末端肽链和其催化活性相关。因此,表征哈维氏弧菌磷脂酶D（VhPLD）的酶学性质并揭示C-末端和N-末端肽链在酶活性发挥中的功能不仅有助于了解酶的结构功能关系,为磷脂酶未来分子改造和工业化应用奠定基础,同时为针对该酶进行由哈维氏弧菌导致的病害防控均具有重要指导意义。本文以磷脂酶VhPLD为研究对象,采用大肠杆菌重组表达技术获得重组表达VhPLD。在此基础上,采用磷脂酰对硝基酚（PpNP）法和单分子层技术对其酶学性质进行分析;并通过设计和构建C-末端和N-末端肽段缺失突变体,比较分析C-末端和N-末端肽缺失前后对磷脂酶VhPLD的酶学性质的影响作用。具体研究内容以及结果如下:（1）野生型VhPLD重组表达菌株的构建及酶学性质研究。首先,构建了磷脂酶VhPLD大肠杆菌重组表达菌株pET21a-VhPLD SHuffle T7,通过诱导表达并经Ni2+亲和层析、G25和Q柱阴离子交换层析得到了目的蛋白。其次,以PpNP为底物测定了其最适反应条件。结果表明:VhPLD磷脂酶活性表现的最适反应温度为45℃,pH为8.0;苯对VhPLD-WT的酶活具有激活作用。最后,基于单分子层技术对其界面吸附特性进行了研究。通过定点突变的方法,设计催化活性中心组氨酸突变体（VhPLD-H157A）,避免水解对吸附过程的影响。以二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸（DMPS）为底物时,最大插入压力（MIP）值最大,结果表明VhPLD-H157A对DMPS单分子层的结合能力最强;用于研究酶蛋白的四种底物（二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（DMPE）、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG）和DMPS）单分子层的协同因子a均大于0,说明四种底物与酶蛋白存在正向的作用;四种底物的初始表面压力增加值（ΔΠ0）均大于其平衡表面压力,进一步证实酶蛋白更易从水下相迁移到到界面并与磷脂结合。（2）C-末端肽链对VhPLD的酶学性质的影响研究。首先,成功构建C-末端截断的大肠杆菌重组表达菌株pET21a-VhPLD-Δ（472-483）SHuffle T7和pET21a-VhPLD-Δ（437-483）SHuffle T7,并获得较纯的目的蛋白。其次,以PpNP为底物测定了其最适反应条件。结果表明:VhPLD-Δ（472-483）的最适温度条件为50℃,VhPLD-Δ（437-483）酶活性的最适温度条件为60℃;VhPLD-Δ（472-483）和VhPLD-Δ（437-483）的最适pH均为8.0;乙酸乙酯和乙醚对C-末端截断突变体的酶活具有明显的促进作用。最后,单分子层技术实验表明:比较MIP值可知,肽链437-472的缺失对VhPLD与DMPE的界面结合有正面促进的作用;比较协同因子a可知,肽链437-472则会促进VhPLD与DMPE的结合;比较ΔΠ0可知,表明肽链472-483和437-472的缺失均有利于其与DMPG的结合。（3）N-末端肽链对VhPLD的酶学性质的影响研究。首先,成功构建N-末端截断大肠杆菌重组表达菌株pET21a-VhPLD-Δ（25-39）SHuffle T7,并获得了较纯的目的蛋白。其次,以PpNP为底物测定了其最适反应条件。结果表明:VhPLD-Δ（25-39）的最适温度条件为45℃,VhPLD-Δ（25-39）的最适pH为8.0;正己烷对N-末端截断突变体的酶活具有促进作用。最后,单分子层技术实验表明:比较MIP值可知,N-端肽链的缺失有助于VhPLD与DMPC和DMPG的界面结合;比较协同因子a可知,N-端肽链的缺失更有利于其与DMPE的结合;比较ΔΠ0可知,N-端肽链的缺失更有利于其与DMPC的结合。