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目的通过体外培养胚胎期SD大鼠神经干细胞(neural stem cells, NSCs),添加同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)进行干预,观察Hcy对神经干细胞增殖能力的影响,并进一步观察其增殖期蛋白表达谱的变化,探讨Hcy对神经干细胞增殖影响的机制；建立HuSH shRNA Plasmid介导的RNA干扰技术体系。方法采用无血清体外细胞培养方法,培养胚胎期大鼠NSCs,将NSCs分为四组：①正常对照组(normal control group)培养基中叶酸含量为4μg/mL,同型半胱氨酸含量为0μg/mL;②叶酸缺乏组(Folic acid-D group)培养基中叶酸含量为0.65μg/mL,同型半胱氨酸含量为0μg/mL;③同型半胱氨酸中度增高组(Hey-medium group)培养基中叶酸含量为4μg/mL,同型半胱氨酸含量为100μg/mL;④同型半胱氨酸高度增高组(Hcy-high group)培养基中叶酸含量为4μg/mL,同型半胱氨酸含量为300μg/mLc采用MTT法检测神经干细胞增殖能力,绘制生长曲线；计数神经球的数量及直径以检测神经球的结球能力；采用台盼蓝染色法检测神经干细胞活力；培养6天后收集增殖期细胞,提取细胞蛋白,进行双向电泳,经考马斯亮蓝染色后使用PD-Quest软件比对蛋白差异点,将筛选出的蛋白点进行质谱鉴定。采用Real-time PCR法检测经质谱鉴定蛋白mRNA表达水平。采用试剂盒检测神经干细胞内ATP含量、SOD活力、MDA水平、ROS含量；测定神经干细胞线粒体呼吸链酶复合物NADH-Q还原酶(CⅠ)、琥珀酸-Q还原酶(CⅡ)、细胞色素还原酶(CⅢ)及细胞色素氧化酶(CⅣ)的活性。采用HuSH shRNA Plasmid为载体建立RNA干扰技术体系。结果添加Hcy后,NSCs增殖水平受到抑制。MTT结果显示,添加Hcy后各时间点细胞活力较正常对照组有所降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。在Hcy添加组,神经球直径明显减少,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)；但神经球数目各组间差异不明显(P>0.05)。将神经球裂解后,计数神经干细胞数目发现,在两组Hcy添加组,细胞数目较对照组有所减少,且呈浓度依赖性趋势(P<0.05)。经台盼蓝染色,发现各组间神经干细胞活力差异不明显(P>0.05)。蛋白质组学结果显示,添加Hcy后神经干细胞增殖期蛋白表达谱发生了明显变化；我们从差异蛋白中挑选出7种蛋白进行质谱鉴定,成功鉴定6种蛋白；其中细胞色素b-c1复合体-亚基2和乌头酸水合酶为线粒体呼吸链和三羧酸循环涉及蛋白,提示Hcy可能是通过影响线粒体的功能而降低神经干细胞增殖的。Real-time PCR结果显示,细胞色素b-c1复合体-亚基2和乌头酸水合酶mRNA水平同样被Hcy抑制。采用试剂盒检测ATP含量发现Hcy降低了神经干细胞的能量合成(P<0.05)；降低了SOD活性(P<0.05),升高了MDA和ROS水平(P<0.05)；且线粒体呼吸链复合酶Ⅰ～Ⅳ的活性均受到不同程度的抑制(P<0.05)。成功建立经HuSH shRNA Plasmid介导的RNA干扰技术体系。结论本实验成功分离、培养了体外胚胎期SD大鼠NSCs,研究结果显示同型半胱氨酸可以抑制NSCs的增殖,降低神经球的结球能力,影响NSCs增殖期蛋白表达谱的水平；在mRNA和蛋白水平均降低细胞色素b-c1复合体-亚基2和乌头酸水合酶的表达；减少细胞内ATP的含量,增加活性氧自由基生成,降低其抗氧化能力,降低线粒体呼吸链复合酶Ⅰ～Ⅳ的活性。建立经HuSH shRNA Plasmid介导的RNA干扰技术体系。