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在兽医临床上,支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)造成猪的感染经常发生,比如该病原菌是导致猪萎缩性鼻炎的主要因素。此外,Bb也是猪呼吸道综合征(Porcine Respiratory Disease Complex,PRDC)的常见病原。然而,目前,Bb是如何突破猪呼吸系统的先天性免疫防御造成感染的,需要进一步研究。猪肺泡巨噬细胞(Porcine Alveolar Macrophages,PAMs),作为猪肺中主要的免疫细胞,起着猪肺“第一道防线”的作用。PAMs主要通过先天性的免疫受体比如Toll样受体(TLRs)、C型凝集素受体(CLRs)或清道夫受体(SRs)识别病原微生物的侵入同时启动先天性免疫反应。越来越多的研究显示清道夫受体尤其是A类清道夫受体在病原菌的识别和吞噬中起着重要的作用。然而,目前对猪清道夫受体的研究还非常有限。进一步,PAMs是否可以通过A类清道夫受体如SRA和MARCO与Bb相互作用还不清楚?目的:为了进一步明确Bb在PRDC中的作用以及解析猪肺泡巨噬细胞与Bb的相互作用机制,本研究的目的主要有两方面(1)明确Bb在PRDC的猪肺中的感染情况(2)解析PAMSs通过A类清道夫受体SRA和MARCO介导Bb的识别和吞噬。方法:(1)为了明确Bb在PRDC的猪肺中感染情况,首先,从上海不同的养猪场收集呼吸症状典型的病猪,剖检后,利用TSA平板,对肺脏中的细菌进行分离和培养。随后,对分离获得的细菌,挑单菌落纯化培养后,扩增16S rRNA基因序列并比对分析,对细菌进行鉴定;其次,对鉴定为Bb的细菌,利用PCR对相关毒力因子包括皮肤坏死毒素(DNT)、百日咳杆菌粘附素(PRN)以及鞭毛蛋白(fla B)进行分析;最后,对Bb分离株进行药敏实验,将纯化好的Bb挑取单菌落液体培养至OD600约为0.6时,将菌液均匀涂布TSA,待菌液稍干时贴药敏纸片,共选18种抗生素,18-24h后测量抑菌圈直径并分析结果。(2)为了解析PAMs通过A类清道夫受体SRA和MARCO介导Bb的识别和吞噬,利用A类清道夫受体的阻滞剂分析A类清道夫受体与Bb的相互作用。首先:Bb分离株培养计数后,利用FITC染料对细菌进行标记,并使用显微镜检测细菌标记的情况;利用流式细胞分析检测不同处理情况下的PAMs对Bb的吞噬作用;其次,利用CHO-SRA、CHO-MARCO及CHO-vector细胞系,通过检测荧光信号强度,进一步证实SRA和MARCO介导对Bb的识别和吞噬。结果:(1)呼吸道综合征的猪肺中Bb的分离、鉴定及特性分析:首先,从15头已鉴定为PRDC的猪肺中共获得5株Bb分离菌株;其次,在对毒力因子分析中发现所有分离株的三种毒力因子检测均为阳性。最后,对Bb分离株进行药敏实验,发现所有分离株对阿莫西林、头孢噻呋、链霉素、氨苄西林等8种药物高度耐药,而对卡那霉素、美罗培南以及庆大霉素高度敏感,部分菌株对红霉素、氟苯尼考、强力霉素以及阿米卡星耐药。(2)PAMs通过A类清道夫受体SRA和MARCO介导Bb的识别和吞噬研究:首先,通过流式细胞分析,发现封闭PAMs上A类清道夫受体介导的吞噬,显著地降低PAMs对Bb的吞噬,说明A类清道夫受体介导PAMs对Bb的识别和吞噬。进一步,我们的研究发现相对于CHO-vector,CHO-SRA或CHO-MARCO显著地增强对Bb的吞噬。说明PAMs可通过A类清道夫受体主要是SRA和MARCO介导对Bb的识别和吞噬。结论:研究显示Bb是引起PRDC的常见病原菌。同时,我们的研究显示了PAMs可通过A类清道夫受体SRA和MARCO介导对Bb的识别和吞噬。该研究结果丰富了PAMs与细菌相互作用的机制,同时,为揭示PRDC的发病机制奠定基础。