目的：肺纤维化（pulmonary fibrosis, PF）是以肺成纤维细胞大量增殖和肺内胶原异常堆积为特征的进行性间质性肺疾病。研究发现，在博莱霉素（bleomycin, BLM）诱导的大鼠肺纤维化形成过程中，大鼠肺内肥大细胞（mast cells, MCs）数目增多。本课题组以往研究发现，大鼠气管内滴注BLM第14天和第28天肺内MCs增多，在肺连续切片上发现MCs分泌结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）。但此发现尚需进一步证实。迄今MCs分泌CTGF的机制尚不清楚。类胰蛋白酶是MCs的特异性标志物。本实验首先用类胰蛋白酶免疫显色方法证实肺纤维化形成过程中肺内MCs数量的增多；并用免疫荧光双标的方法证实MCs表达CTGF；在此基础上，通过观察氨基胍（aminoguanidine, AG）和黄芩苷（Baicalin, Bai）对肺纤维化形成过程中大鼠肺内MCs数量以及表达CTGF的影响，以期阐明肺纤维化形成过程中肺内MCs数量增多的机制以及MCs表达CTGF的机制。方法：免疫组化方法检测MCs的数量；免疫荧光双标的方法验证MCs表达CTGF；用HE染色观察肺组织形态学变化。将52只健康清洁级Sprague-Dawley（SD）（♂）（体重170-180g）大鼠随机分成三组：1.动态观察组（n=8）：分两个时间点即14d和28d大鼠于气管内一次性滴注BLM（5mg/kg）或NS（0.5ml/kg)后第15d和29d被处死取肺。2.早期给药组（即1-14d给药组）（n=21）：14dNS+14dNS大鼠（n=3）于气管内一次性滴注NS（0.5ml/kg）后，每天腹腔注射NS（1ml/kg），连续14d；14dM+14dNS大鼠（n=8）于气管内一次性滴注BLM（5mg/kg）后，每天腹腔注射NS（1ml/kg），连续14d；14dM+14dBai大鼠（n=5）于气管内一次性滴注BLM（5mg/kg）后，每天腹腔注射Bai（12.5mg/kg），连续14d；14dM+14dAG大鼠（n=5）于气管内一次性滴注BLM（5mg/kg）后，每天腹腔注射AG（20mg/kg），连续14d。此组大鼠于第15d取肺。3.晚期给药组（即14-28d给药）（n=23）：28dNS+后14dNS大鼠（n=3)于气管内一次性滴注NS（0.5ml/kg）后第14d至28d期间，每天腹腔注射NS（1ml/kg）；28dM+后14dNS大鼠（n=8）于气管内一次性滴注BLM（5mg/kg）后第14d至28d期间，每天腹腔注射NS（1ml/kg）；28dM+后14dBai大鼠（n=6）于气管内一次性滴注BLM（5mg/kg）后第14d至28d期间，每天腹腔注射Bai（12.5mg/kg）；28dM+后14dAG大鼠（n=6）于气管内一次性滴注BLM（5mg/kg)后第14d至28d期间，每天腹腔注射AG（20mg/kg）。此组大鼠于第29d取肺。以上各组大鼠均在规定的时间点取肺，肺组织用于检测MCs及CTGF免疫阳性的MCs数量和形态学观察。采用人工计数法，每张免疫组化切片随机选取5个高倍不重叠视野准确计数MCs，每只大鼠计数肺组织不同部位3张切片计算MCs的平均值。每张免疫荧光组化切片随机选取3个低倍不重叠视野准确计数MCs及CTGF免疫阳性的MCs数量，每只大鼠计数肺组织不同部位3张切片计算MCs及CTGF免疫阳性的MCs数量的平均值。所有数据均用均数±标准差（x±SD）表示，采用SPSS13.0统计软件，多个样本均数比较用单因素方差分析（One-way ANOVA），多个样本均数间的两两比较用最小显著差法（Least significant difference, LSD），以P<0.05为有显著性差异。结果：1肺纤维化形成中肺内MCs及CTGF免疫阳性的MCs数量的变化1.1MCs数量的动态变化：免疫组化和免疫荧光显色结果显示：与对照组大鼠相比，BLM大鼠肺内类胰蛋白酶免疫阳性染色的MCs数量第14天和第28天增多（P<0.01, P<0.001）。与14dM大鼠相比，28dM大鼠肺内类胰蛋白酶免疫阳性染色的MCs数量的变化无统计学意义(P>0.05)。1.2类胰蛋白酶与CTGF共存的MCs数量的动态变化：与对照组大鼠相比，BLM大鼠肺内类胰蛋白酶与CTGF共存的MCs数量在第14天和第28天增多（P<0.001）。与14dM大鼠相比，28dM大鼠肺内类胰蛋白酶与CTGF共存的MCs数量的变化无统计学意义（P>0.05）。与对照组大鼠相比，14dM和28dM大鼠肺内类胰蛋白酶与CTGF共存的MCs占肺内总MCs的百分比略有增加，但无统计学意义（P>0.05）。与14dM大鼠相比，28dM大鼠肺内类胰蛋白酶与CTGF共存的MCs占肺内总MCs的百分比的变化无统计学意义（P>0.05）。2AG和Bai对肺纤维化形成早期（1-14d）肺内MCs及CTGF免疫阳性的MCs数量的影响2.1早期肺内MCs数量的变化：免疫组化和免疫荧光显色结果显示：与14dNS+14dNS大鼠相比，14dM+14dNS大鼠肺内类胰蛋白酶免疫阳性染色的MCs数量明显增多（P<0.001）。与14dM+14dNS大鼠相比，14dM+14dAG和14dM+14dBai大鼠肺内类胰蛋白酶免疫阳性染色的MCs数量明显减少（P<0.001, P<0.01）。2.2早期肺内类胰蛋白酶与CTGF共存的MCs数量的变化：与14dNS+14dNS大鼠相比，14dM+14dNS大鼠肺内类胰蛋白酶与CTGF共存的MCs数量增多（P<0.001）。与14dM+14dNS大鼠相比，14dM+14dAG和14dM+14dBai大鼠肺内类胰蛋白酶与CTGF共存的MCs数量减少（P<0.01）。与14dNS+14dNS大鼠相比，14dM+14dNS大鼠肺内类胰蛋白酶与CTGF共存的MCs占肺内总MCs的百分比略有增多，但无统计学意义（P>0.05）。与14dM+14dNS大鼠相比，14dM+14dAG和14dM+14dBai大鼠肺内类胰蛋白酶与CTGF共存的MCs占肺内总MCs的百分比略微减少，但统计学无显著性意义（P>0.05）。3AG和Bai对肺纤维化形成晚期（14-28d）肺内MCs及CTGF免疫阳性MCs数量的影响3.1晚期肺内MCs数量的变化：免疫组化和免疫荧光显色结果显示：与28dNS+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dNS大鼠肺内类胰蛋白酶免疫阳性染色的MCs数量明显增多（P<0.001）。与28dM+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dAG和28dM+后14dBai大鼠肺内类胰蛋白酶免疫阳性染色的MCs数量明显减少（P<0.001, P<0.01）。3.2晚期肺内类胰蛋白酶与CTGF共存的MCs数量的变化：与28dNS+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dNS大鼠肺内类胰蛋白酶与CTGF共存的MCs数量增多（P<0.01）。与28dM+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dAG和28dM+后14dBai大鼠肺内类胰蛋白酶与CTGF共存的MCs数量减少（P<0.01）。与28dNS+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dNS大鼠肺内类胰蛋白酶与CTGF共存的MCs占肺内总MCs的百分比增多（P<0.05）。与28dM+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dAG和28dM+后14dBai大鼠肺内类胰蛋白酶与CTGF共存的MCs占肺内总MCs的百分比略微减少，但统计学无显著性意义（P>0.05）。4AG和Bai对肺纤维化形成早期和晚期肺组织形态学（HE染色）的影响4.1肺纤维化形成过程中肺组织形态学观察结果：14dNS和28dNS大鼠肺结构正常，无炎症表现。14dM和28dM大鼠肺泡腔充满大量炎细胞，肺间隔增宽，局部有肺实变。4.2早期肺组织形态学观察结果：14dNS+14dNS大鼠肺组织结构正常，无炎症表现。14dM+14dNS大鼠肺间隔明显增宽。与14dM+14dNS大鼠相比，14dM+14dAG和14dM+14dBai大鼠上述形态学改变明显减轻。4.3晚期肺组织形态学观察结果：28dNS+后14dNS大鼠肺组织结构正常，无炎症表现。28dM+后14dNS大鼠肺间质细胞明显增多，肺泡壁增厚，局部有肺实变。与28dM+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dAG和28dM+后14dBai大鼠上述形态学改变明显减轻。结论:1.在肺纤维化形成过程中，大鼠肺内MCs增多，MCs表达CTGF。2.在肺纤维化早期和晚期阶段，AG和Bai均可减少模型大鼠肺内MCs及CTGF免疫阳性的MCs的数量。提示AG下调NO的含量和Bai的抗氧化损伤作用来减少模型大鼠肺内MCs及CTGF免疫阳性的MCs的数量。