目的：头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)自从1948年被Brotsu发现，以及从礼莱公司在1964年上市第一个头孢菌素头孢噻吩以来，头孢菌素作为一类广谱半合成抗生素，至今已有60多个上市品种，并已从第一代发展到第四代。头孢菌素和青霉素都具有β-内酰胺特征，不同的是青霉素母核是由β-内酰胺环和五元噻唑环构成，而头孢菌素母核则是由β-内酰胺环和六元二氢噻嗪环构成，这种结构上的差异，使它能抗拒β-内酰氨酶(如金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的β-内酰氨酶，但不包括超广谱β-内酰胺酶。)的降解。而且头孢菌素具有高效、低毒、抗菌谱广、过敏反应少、可以口服、品种多等优点。 头孢菌素作为一类广谱半合成抗生素，它可以分为以7-氨基-3-去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)为母核和以7-氨基头孢烷酸(7-ACA)为母核的两大系列。以7-ADCA为母核系列是青霉素的深加工产品，利用7-ADCA可以合成头孢羟氨、头孢拉定、头孢克罗、头孢他美酯等头孢菌素类抗生素药物。由于这些头孢菌素类抗生素可以口服且疗效良好，使人们不断寻找成功制备这些头孢类抗生素的关键中间体7-ADCA经济有效的方法。 当前通过青霉素工业盐扩环得到7-ADCA的主要方式是采用化学法扩环。但化学扩环反应要求有对羟基的“保护”和“去保护”过程等多步反应，步骤繁琐，自动化水平低，且反应过程中不可避免的有开环副反应，影响产品收率和质量。化学法反应条件苛刻，使用大量的有机溶剂(如吡碇)，对环境造成污染。由于化学法的弊端，使人们在清楚了头孢菌素的生物合成途径后积极寻找适当的生物工程途径进行扩环。因此，青霉素扩环酶成为当今工业酶研究中的一大热点。自1976年Kohsaka首先对低等真核生物顶头孢菌的扩环酶进行研究，至今扩环酶的研究得到迅速发展。以棒状链霉菌为来源的扩环酶由于具有潜在的工业应用价值而得到研究者的极大关注。在九十年代以前，只发现其以青霉素N作为底物的扩环活性。随着研究的不断深入，发现扩环酶对青霉素G有很弱的扩环活性。青霉素G作为一种生物发酵最终产物，可以方便、廉价地获得，所以扩环酶是否能有效地以青霉素G作为底物扩环产生头孢菌素半合成重要中间体7-ADCA，并进行工业化生产成为人们研究的焦点。 本研究的目的：1．克隆棒状链霉菌的扩环酶基因，构建高表达的原核载体。2．在原核细胞中表达扩环酶，建立扩环酶的高效表达平台。3．以青霉素G为底物建立扩环酶活性检测体系。4．进行扩环酶结构的改造，探索其工业化生产的可能性。 方法 1．扩环酶基因克隆及原核表达工程菌的构建以从Streptomyces clavuligerus(ATCC-27064购自美国典型菌种培养物保藏中心)抽提得到的基因组DNA为模板，利用PCR方法扩增得到扩环酶基因片段。将获得的PCR片段连接到pGEM-T easy载体中获得插入扩环酶基因的质粒pGEM-T easy/cefE。由于扩环酶的底物是β-内酰胺类物质，为了避免将来在扩环酶表达产物中含有β-内酰胺类物质，将质粒pET-3b中Ampicillin抗性基因替换成kanamycin抗性基因。 用NdeI和BamHI酶切质粒pGEM-T easy/cefE，将得到cefE片段连接到已经用NdeI和BamHI酶切处理的原核表达载体pET3b/Kan中。 将经过酶切鉴定，确认构建正确的pET3bKan/cefE原核表达载体通过CaCl<,2>法转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)、BL(DE3)RP、BL21(DE3)RIL，鉴定后获得重组的扩环酶原核表达菌株。 2.扩环酶基因的表达纯化以及活性的检测用IPTG诱导表达后，收集菌体超声裂解破碎细胞，使之释放出可溶性的扩环酶蛋白，并离心获上清液，将得到的上清液作为粗酶反应液进行活性检测。 在反应体系中按照顺序分别加入扩环酶扩环活性所必需的各种反应辅助因子，以及底物penicillin G，最后加入粗酶蛋白提取液。反应温度为36℃，在摇床中220转每分钟反应1小时，然后加入等体积甲醇终止反应。 通过HPLC方法以合成的苯乙酸-7-ADCA(G-7-ADCA、)为标准品并绘制标准曲线，进行定量检测扩环反应后的产物G-7-ADCA。 3.扩环酶基因的改造由于扩环酶与青霉素生物合成过程中的异青霉素N环化酶(IPNS)结构具有一致性，其C端氨基酸形成的空间结构对与底物的亲和性有很大影响，于是设计了五种不同的方案对扩环酶蛋白进行改造。并将改造后的扩环酶分别称为GQY，GTY，RL，ARL，N-L。利用错误倾向性PCR和DNA shuffling对扩环酶进行体外定向进化，以筛选对青霉素G底物高亲和性和热稳定性佳的扩环酶，探索扩环酶工业化应用的可能性。 结果 1．扩环酶基因克隆及原核表达工程菌的构建通过PCR扩增的方法，从棒状链霉菌中获得了野生型的扩环酶基因，并测定了其核酸序列，完成了扩环酶的原核表达质粒pET3bKan/cefE的构建。 2．扩环酶基因的表达以及活性的检测将鉴定得到带有扩环酶基因的表达质粒的不同大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，BL(DE3)RP、BL21(DE3)RIL各挑选单克隆，选用2×YT、LB两种培养基进行发酵研究，经IPTG诱导，诱导产物经SDS-PAGE还原电泳，银染观察分析。筛选得到扩环酶蛋白的表达菌株。 为了表达后酶活性检测分析，有利于酶蛋白的释放和纯化，优化发酵条件，将培养基确定为丰富培养基2xYT，菌种培育温度由37℃改为33℃，并降低诱导温度，由37℃变为28℃。使之由包涵体的表达形式改为可溶性的表达形式。经过发酵条件的优化后，目标蛋白的表达量一般能稳定的占到菌体总蛋白量的30-50％，最高能达到60-70％。 在最初的Tris缓冲体系中，扩环酶对青霉素G的转化率小于1％，经过扩环酶反应体系优化实验，发现改变酶反应的缓冲体系，如改用MOPS、HEPES等生物缓冲体系能够提高扩环酶对青霉素G的转化效率。而且在使用细胞抽提物，以青霉素G作为底物进行扩环反应时，ATP、MgSO<,4>和KCl等并无重要的作用，最终确定了一个优化后的反应体系。反应完成后采用HPLC方法进行反应产物的检测，并以标准的G-7-ADCA为标准品进行定量检测反应产物G-7-ADCA。结果显示采用优化后的扩环反应体系，扩环酶对青霉素G的扩环转化效率能达到10％以上。 3．扩环酶基因的改造经过对改造后的五种酶蛋白的扩环活性测定分析，发现其中的RL和野生型扩环酶在同样实验操作下，其活性要高，对青霉素G的转化效率能够达到15％。 利用错误倾向性PCR和DNA shuffling相结合的方法构建了扩环酶大肠杆菌表达文库，以期望能筛选得到对底物青霉素G高亲和性的扩环酶，使其能适用于工业化的酶工程中。 结论 1．本实验以棒状链霉菌扩环酶为研究对象，通过PCR克隆得到野生型的扩环酶基因。 2．构建了可溶性高表达扩环酶的基因工程菌株，建立了扩环酶在大肠杆菌中高效表达的平台。 3．优化以及简化扩环酶的反应体系，获得良好的实验结果。 4．设计了五种经过人工改造的扩环酶，并获得扩环效率更高的突变体RL。 5．利用蛋白质的定向进化方法错误倾向PCR和DNA shuffling方法构建了扩环酶的表达文库。