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研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)斑块的不稳定所导致的斑块破裂进而继发的血栓形成是引起急性心血管事件的最主要原因。近年研究证明,斑块内血管新生(neovascularization)与AS斑块稳定性密切相关。血管新生受复杂机制的调控,在正常的机体中激活因子与抑制因子处于动态平衡的状态,但在某些条件下,此平衡被打破,促血管新生的因子就会被激活,进而促进新生血管的形成。研究表明斑块内缺血、缺氧以及炎症反应是引起AS斑块内血管新生的重要原因。大量研究证明斑块不稳定性与斑块内新生血管的数量增加密切相关。这是由于新生血管具有渗透性高、脆性大等特点。新生血管的高渗透性使其成为炎性因子和脂质进入斑块内的通道,加重了斑块内炎症反应与脂质沉积。新生血管仅由一层内皮细胞构成,具有脆性大的特点,易导致斑块内出血的发生,使斑块成为不稳定斑块。但以上为不同学者在不同动脉粥样硬化阶段中的不同研究中获得的,缺乏系统的纵向研究观察缺氧、炎症因子的动态改变对斑块内血管新生的影响。本研究拟动态观察动脉粥样硬化发生、发展过程中斑块内巨噬细胞、炎症因子、缺氧诱导因子、生长因子和新生血管数量的变化趋势以及其之间的相关性。研究目的1,明确在AS斑块发生、发展过程中缺氧与斑块内血管新生的关系。2,明确在AS斑块发生、发展过程中炎症与斑块内血管新生的关系。方法1模型的建立：60只三月龄纯种新西兰雄性大白兔,给予球囊拉伤+高胆固醇饮食(1%胆固醇,每只120-140g/d),12周后改为普通饲料饮食,并分别于球囊拉伤后4周、6周、8周、10周、12周、14周、16周、18周、20周、22周及24周分别处死5只实验动物。2血液生化指标及炎性因子的检测：分别于实验开始前,球囊拉伤后4周开始,每两周末处死5只动物前作血液生化检查。禁食12小时以上,测量体重后,经耳缘静脉抽取空腹血,留取血清检测各个时间点血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)及高密度脂蛋白(HDL-C)。3免疫组织化学染色以及斑块形态学分析：从球囊拉伤后4周开始,每两周随机安乐死5只实验兔,应用RAM-11和CD31抗体检测其腹主动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞和新生血管的数量及分布,利用免疫组织化学染色法检测斑块内CRP、 ICAM-1、VCAM-1、TNF-α、HIF-1α、VEGF-A、PDGF-BB和FGF-2的表达情况,光镜下所见黄褐色颗粒即为阳性表达,用Image pro plus6.0彩色显微图像分析软件进行半定量分析IOD值。每个时间点每只实验兔随机选取5张切片,测定阳性染色积分光密度值(IOD),其平均值作为每只实验兔的IOD值。IOD值越高表明组织内RAM-11、ICAM-1、VCAM-1、TNF-α、CRP、HIF-1α、 VEGF-A、PDGF-BB、FGF-2的含量越高。斑块内新生血管的测定,每组随机选取5张DAB切片,数每张切片斑块内CD31表达的环状的个数,取5张切片的平均值作为每组的CD31表达量。4统计学方法：实验所得数据均以平均数±标准差(x±s)表示,并采用SPSS18.0统计软件包进行数据处理分析。多组间的比较用单因素方差分析。使用相关性分析分析两组数据之间的相关性,P<0.05时,表明差异具有统计学意义。结果1实验动物一般情况实验过程中,所有实验兔在球囊拉伤手术后均恢复良好,在实验过程中一般状态良好,无疾病以及死亡的出现。2各时间点实验兔血液生化指标各时间点实验兔TC, LDL水平都在12周达到高峰,第12周TC、LDL分别是4周的2.5倍与2倍,12周后由高胆固醇饮食替换为普通饮食,此后TC与LDL开始下降,到24周逐渐恢复至基线水平,但HDL与TG在整个过程中无明显变化。3组织病理学染色。HE染色可见实验兔斑块从4周开始至24周逐渐增大,8周时可见斑块内有少量红细胞出现,提示可能在球囊拉伤后8周时开始出现斑块内新生血管。4免疫组织化学染色RAM-11染色可见从4周起斑块内巨噬细胞数量逐渐增多,至12周达到最高峰后开始回落。免疫组织化学染色可见从4周到24周斑块内ICAM-1、VEGF-A、 TNF-α、HIF-1α、FGF-2表达呈现出同样趋势。而斑块内VCAM-1、CRP的表达也在12周达到高峰,但随后其表达量并未回落,依然高水平表达。PDGF-BB染色显示斑块内PDGF-BB的表达从4周开始逐渐缓慢增加至24周达到高峰。CD31染色证实第8周末于斑块基底部(内弹力板处)开始出现新生血管,随斑块增大及炎症反应增强,斑块内新生血管数量逐渐增多,并逐渐向内皮下生长。在斑块的早期(4周至12周),相关性分析显示HIF-1α的表达与CD31相关(r=0.469,p<0.05),与VEGF-A也密切相关(r=0.625,p<0.05)；而在斑块的进展期(14周至24周),HIF-1α的表达量明显减少,且与CD31无相关。在斑块形成的早期(4周至12周)ICAM-1、VCAM-1二者与斑块内血管新生密切相关(r=0.550,P<0.05; r=0.762,P<0.05), ICAM-1、VCAM-1、TNF-α、CRP四者都与VEGF-A、 FGF-2, PDGF-BB密切相关。而球囊拉伤后14-24周,以上因子间均无相关性。结论1、本实验首次发现了在新西兰大白兔动脉粥样硬化模型中,于球囊拉伤加高脂饮食后第8周末可见斑块内开始有新生血管的出现,新生血管早期在缺氧、炎症等因素作用下,自外膜向内皮下生长。2、缺氧可能通过HIF-1α-VEGF-A通路来促进斑块内的血管新生,但缺氧只在斑块形成的早期起到促进血管新生的作用。3、在斑块形成阶段,炎症可以通过多种促生长因子如VEGF-A、FGF-2和PDGF-BB发挥促进斑块内血管新生作用。4、VEGF-A和FGF-2主要发挥促进仅由简单的内皮细胞构成,没有基底膜与周围结缔组织支撑的不成熟新生血管,而PDGF-BB则可通过募集周细胞而发挥促进斑块内新生血管的成熟作用。