结核病正对人类构成巨大的威胁。目前全球接近32%的人口已感染了结核杆菌。每年约有300万人死于结核病,平均每天死亡超过8000人。更为严重的是近十几年来由于结核耐药株增多和HIV/AIDS的蔓延,结核病发病率增高,已经成为传染病中的第二大杀手。目前全球广泛使用的唯一的结核病疫苗是卡介苗(BCG)。至今已有30亿以上的人接种了BCG,并且每年有1亿左右的新生儿接种此疫苗。它可以较好的阻止年幼儿粟粒型结核及结核性脑膜炎的发生。但是,它不能保护最常见的成人肺结核的发生。所以研制新型的结核疫苗刻不容缓,这对于控制结核传染具有非常重大的意义。当前疫苗研究的主要有两个方向;(1)研制重组卡介苗,使其比亲代卡介苗具有更强的抗原性和免疫性,以代替现在使用的卡介苗;(2)研制亚单位疫苗,用于BCG免疫后的加强免疫。因此本研究工作包括两个方面;重组BCG疫苗的研究和嵌合蛋白亚单位疫苗的研究。1.重组BCG疫苗的研究BCG是很好的活的疫苗载体,可以诱导较强的细胞免疫和体液免疫反应。将一些重要的结核杆菌抗原基因导入BCG,让BCG大量表达保护性抗原,有望诱导比BCG强大而又持久的免疫保护力。本研究选择结核分枝杆菌最重要的保护性抗原Ag85B,BCG在传代过程中丢失的保护性抗原ESAT-6及重要的细胞因子IFN-γ,重组入BCG,构建了三株重组BCG菌株,分别是rBCG-Ag85B(简称rBCG-A)、rBCG-Ag85B-ESAT6(简称rBCG-AE)、rBCG-Ag85B-ESAT6-IFNγ(简称rBCG-AEI),其中rBCG-AEI的构建是国内外首次报道。我们在BCG和三株重组BCG菌株免疫C57BL/6小鼠后,通过分析抗体IgG水平、IgG2b/IgG1和IFN-γ的分泌,比较了它们的免疫原性。研究结果表明,三株重组BCG针对特异抗原均可以引起特异性的较BCG强的体液免疫和细胞免疫反应。其中rBCG-AEI的免疫原性较高,而且还能诱导较其它重组BCG高的Th1反应,而后者是成为成功疫苗的重要因素。而且我们进一步观察了重组BCG的免疫保护效果。皮下免疫C57BL/6小鼠和豚鼠(剂量分别为5×10~6和5×10~4 cfu),8周后给予结核杆菌毒力标准株H37Rv攻击,观察攻击后菌落计数、体重变化和组织病理变化。研究结果显示攻击后9周rBCG-AEI免疫的小鼠肺部菌落数较少,净体重增加。虽然肺部组织的病理改变与BCG和其它重组BCG无明显差别,但抗酸染色显示rBCG-AEI免疫的小鼠肺部组织的结核杆菌数最少。因此rBCG-AEI能够产生与BCG,rBCG-A和rBCG-AE相当甚至更好的保护作用。当然为了进一步区分重组BCG与BCG疫苗的保护效率差异,还需要延长毒力株攻击后观察时间。2.嵌合蛋白亚单位疫苗的研究Ag85B,ESAT-6是结核杆菌重要的保护性抗原。其抗原表位已得到广泛研究,其中ESAT-6的T细胞抗原表位位于蛋白分子的N端及第51～60氨基酸之间;Ag85B的T细胞抗原表位位于蛋白分子C端的第241～260氨基酸之间和第261～280氨基酸之间。我们依据Ag85B,ESAT-6的T细胞抗原表位,将ESAT-6插入到Ag85B第169～182氨基酸之间形成嵌合蛋白;Ag85B_N-ESAT-6-Ag85B_C。研究发现这种新的嵌合蛋白疫苗与佐剂MPL-TDM共免疫小鼠后,IgG2b/IgG1的比例和IFN-γ的分泌都比Ag85B-ESAT-6融合蛋白高,后者已被报道在结核杆菌感染后可以产生与BCG相似的保护效果。因此,Ag85B,ESAT-6嵌合亚单位疫苗有可能成为一种有效的新的蛋白多肽疫苗而用于结核分枝杆菌的预防。该研究还提出了一种根据T细胞表位设计亚单位疫苗的新策略。