疼痛不仅仅被认为是一种症状,更被看作是一种疾病。近年来,慢性痛的发生率逐年增高,越来越多的人遭受着慢性痛的折磨,生活质量和身心健康都受到了严重的危害,痛不欲生。并且慢性痛发病周期长,难以治愈,更使得患者对于慢性痛的治疗产生巨大的花费[1]。长期遭受慢性痛还会使患者产生抑郁、恐惧及焦虑等不良情绪,严重危及患者的社交活动和人际关系。近年来,随着人们在细胞和分子水平研究的深入,慢性痛的机制研究取得了长足的进展。但是,不容乐观的是从治疗上看,当前用于临床上的镇痛药还是仅限于阿片类和非甾体类抗炎药两大类,由于前者可以引起精神成瘾、耐受和其他严重毒副作用,所以使用受限,而后者更因为对很多痛无良效,所以并不是广谱有效的镇痛药。因此免除疼痛是患者的权利,而研究疼痛的发生发展机制,研发新型的镇痛良药,解除疼痛则是我们每一个疼痛研究者的职责和目标。瞬时感受器电位(Transient receptor potential,TRP)通道是位于细胞膜上的一类钙通透的非选择性阳离子通道超家族,分为TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPP和TRPML 6个亚家族[2]。近年来越来越多的实验证据表明TRP在痛觉信息的传递过程中响应细胞及机体内外的伤害性冷、热、机械和化学等刺激,并将其转换为动作电位向脊髓及上位脑中枢传递并最终产生痛感觉[3,4]。众所周知,TRPV1主要负责感受细胞内外伤害性热、酸性环境等刺激[5];TRPM8编码细胞对冷觉的感受[6];TRPA1则可被细胞环境中的化学刺激物所激活[7]。在损伤或炎症等病理状态下,上述通道亚型呈现表达上调、功能增强的可塑性改变,在慢性痛发生发展中发挥重要作用[3,4]。TRPC(Transient receptor potential canonical)通道是TRP通道超家族中最先被克隆的亚家族,但由于缺乏有效的选择性工具药,使得人们对TRPC通道的功能认识远远滞后于其它TRP通道。TRPC通道包括7个亚型,根据其结构和功能的相似度和相近性分为三个亚群:分别是TRPC1/4/5、TRPC2、TRPC3/6/7[2]。亚群内的通道蛋白在结构和功能上表现出极大的冗余性,因此选择TRPC1/4/5 TKO小鼠进行研究。日前,研发针对疼痛信息产生“源头”的TRP通道的新一代镇痛药已经迈开历史的步伐,该类镇痛药可望从源头上消除慢性痛信号的产生和传入,又可以阻止中枢敏化的进一步形成,达到“一石二鸟”、低毒高效的镇痛效果[3,8]。因此,探讨TRP通道亚型参与疼痛信息感受、传递和敏化的作用及作用机制已成为生命科学研究的前沿热点问题。第一部分:探讨TRPC1/4/5通道在正常生理状态下感受外周感觉信息的作用及病理情况下的致痛敏作用目的:观察TRPC1/4/5通道在正常生理状态下感受外周感觉信息的作用及病理情况下的致痛敏作用。方法:在正常生理状态下检测TRPC1/4/5基因敲除小鼠与野生型小鼠对机械刺激以及热刺激反应性的差别。小鼠一侧后肢足底皮下注射完全弗氏佐剂(CFA)建立慢性炎性病理性疼痛模型,检测造模前和造模后不同时间点基因敲除小鼠与野生型小鼠对机械刺激和热刺激反应性的差别。一侧后肢足底注射炎性介质缓激肽,检测其诱发的自发痛行为反应在两种基因型动物之间的差别。采用转轴实验来验证TRPC1/4/5基因敲除后是否会影响小鼠的运动协调能力。结果:在生理状态下,TRPC1/4/5基因敲除小鼠对机械刺激和热刺激的反应性较野生型小鼠显著下降。进一步研究发现在CFA诱致的慢性炎性痛状态下,TRPC1/4/5基因敲除后可显著减弱小鼠对机械刺激和热刺激的反应性;同时,炎性介质缓激肽诱致的小鼠自发痛行为反应也在TRPC1/4/5基因敲除后受到明显抑制。转轴实验结果显示TRPC1/4/5通道敲除后对小鼠的运动协调能力无显著影响。第二部分:TRPC1/4/5通道参与介导外周敏化的作用机制目的:探讨TRPC1/4/5通道对DRG伤害性感受器兴奋性的影响方法:取正常健康成年小鼠,在正常状态下以及建立CFA慢性炎性痛模型24 h后,采用全细胞膜片钳记录技术比较野生型小鼠和敲除小鼠L4-L5 DRG伤害性感受神经元被动膜特性和主动膜特性之间的差异。结果:结果显示在正常生理情况下,野生型小鼠和敲除小鼠的被动膜特性如静息膜电位(RMP)、膜电阻(Rm)和膜电容(Cm)均无显著性差异通过向DRG神经元内注入去极化电流诱致动作电位检测主动膜特性时发现,TRPC1/4/5基因敲除小鼠诱致动作电位(action potential,AP)产生所需的基强度显著高于野生型小鼠。同时,注入相同强度的去极化电流诱致AP的发放频率也较野生型小鼠显著降低。这一结果提示TRPC1/4/5通道在决定生理状态下DRG伤害性感受神经元的兴奋性中发挥着重要的作用同样采用全细胞膜片钳记录技术在CFA诱致后24h的病理情况下对野生型小鼠和敲除小鼠L4-L5 DRG伤害性感受神经元被动膜特性和主动膜特性进行记录。结果发现在CFA诱致的炎性病理痛状态下,野生型动物在CFA后与正常状态下比较兴奋性显著升高,具体表现在DRG神经元诱致AP的基强度与正常状态下相比,CFA注射后基强度显著减小。DRG神经元AP的频率与正常状态下相比,CFA注射后显著增强。而敲除小鼠与野生型小鼠相比,兴奋性显著低于野生型小鼠。上述结果提示TRPC1/4/5通道在决定病理状态下的DRG伤害性感受神经元的超兴奋状态中发挥着关键作用。第三部分:TRP1/4/5通道对炎性痛小鼠脊髓背角c-Fos和p-ERK表达的影响目的:进一步探讨TRPC1/4/5通道发挥的致痛敏作用是否是通过增强脊髓背角痛觉神经元的反应性来实现的。方法:小鼠后肢足底皮下注射福尔马林,2 h后灌注、取小鼠腰膨大脊髓、后固定、脱水、行冰冻切片,片厚30mm,采用免疫组化ABC法进行染色。结果:免疫组织化学染色结果显示野生型小鼠足底皮下注入福尔马林可诱致L4-L5节段脊髓背角浅层神经元c-Fos和p-ERK的表达显著上调。与野生型小鼠相比,TRPC1/4/5基因敲除小鼠上福尔马林诱致的c-Fos和p-ERK的表达上调被显著抑制。第四部分:TRPC1/4/5通道发挥致痛敏作用的中枢敏化机制目的:进一步明确TRPC1/4/5通道发挥致痛敏作用的细胞和分子机制方法:采用生后15-21 d的小鼠,在正常状态下以及建立CFA慢性炎性痛模型24 h后,制作脊髓薄片标本,对脊髓背角I层的神经元进行全细胞膜片钳记录。观察基因敲除小鼠和野生型小鼠脊髓背角I层神经元兴奋性的差异以及TRPC1/4/5通道对伤害性初级传入突触传递效能及可塑性改变的影响。记录脊髓背角I层神经元的被动和主动膜特性;记录刺激伤害性初级传入纤维在脊髓背角I层神经元诱发的兴奋性突触后电流(e EPSCs),以及脊髓背角I层神经元自发兴奋性突触后电流(s EPSCs)。结果:在正常生理状态下,采用不同刺激强度刺激初级传入纤维后根进入区记录在脊髓背角I层神经元诱发的e EPSCs。绘制刺激-反应曲线(input-output curve,I-O曲线)发现随着刺激强度的增大,e EPSCs的幅度也随之增大。比较e EPSCs的I-O曲线发现,TRPC1/4/5基因敲除小鼠的I-O曲线呈现明显右移和下移,即敲除小鼠e EPSCs的幅值明显低于野生型小鼠。这一结果提示TRPC1/4/5通道在脊髓背角的正常兴奋性突触传递中发挥重要作用。CFA注射后,野生型小鼠e EPSCs的幅值较正常状态下显著增强,表现为I-O曲线较正常状态的I-O曲线明显左移和上移,这一结果提示炎症损伤状态下,脊髓背角初级传入突触传递发生了显著的可塑性改变。与野生型小鼠相比,TRP1/4/5 TKO小鼠在CFA注射后e EPSCs的可塑性改变被明显减弱我们同时还对炎症病理情况下TRPC1/4/5通道对自发突触传递的作用进行了观察。经对野生型小鼠和敲除小鼠s EPSCs的频率和幅值进行比较,结果显示TRPC1/4/5通道敲除后s EPSCs的频率和幅度都被显著地抑制,这一结果提示TRPC1/4/5通道对兴奋性突触传递和可塑性改变的作用是突触前机制和突触后机制共同介导的。在生理状态以及慢性炎性痛状态下观察到TRPC1/4/5基因敲除小鼠DRG神经元和脊髓背角神经元的兴奋性与野生型小鼠相比明显下降。具体表现为神经元动作电位(AP)的放电频率减少、幅度降低、半宽增大、阈值升高、基强度升高。结论:1.利用基因敲除小鼠这一工具,全面揭示了TRPC1/4/5通道可能在协同感受外周的机械性和热刺激方面发挥着重要作用。首次明确提出TRPC1/4/5通道在慢性病理性痛中可能发挥致痛敏作用。2.首次揭示TRPC1/4/5可能通过增强外周敏化介导致痛敏作用的细胞分子机制。炎症或损伤后,外周敏化被认为是介导慢性痛发生发展的重要神经机制。TRPC1/4/5通道在正常状态下DRG伤害性感受神经元的兴奋性以及炎症损伤诱致的超兴奋状态中发挥关键作用。3.TRPC1/4/5通道对疼痛等伤害性刺激诱致的脊髓背角浅层神经元活动的增强以及致痛物质的表达过程都发挥了重要的作用。4.首次揭示TRPC1/4/5进一步通过增强初级传入突触传递及可塑性改变介导致痛敏作用的细胞分子机制。炎症或损伤后,外周敏化和初级传入突触可塑性改变均被认为是介导慢性痛发生发展的重要神经机制。TRPC1/4/5通道敲除后显著抑制脊髓背角Ⅰ层神经元的e EPSCs及其可塑性增强。s EPSCs的进一步分析揭示TRPC1/4/5通道可能是通过增强初级传入纤维终末突触前递质的释放机率和突触后受体反应性共同介导其对兴奋性突触传递和可塑性的影响,进而发挥致痛敏作用的。