第一部分Ca2+/CaN-NFATc信号通路在哮喘发病机制中作用的研究第一节钙调神经磷酸酶在哮喘大鼠气道重塑中的作用目的：通过测定哮喘大鼠肺组织中钙调神经磷酸酶(Calcineurin, CaN)蛋白、mRNA的表达及CaN活性,探讨CaN在哮喘大鼠气道重塑中的作用。方法：将20只Wistar大鼠随机分为哮喘组和对照组,每组10只。用10%卵白蛋白(o valbumin，OVA)溶液致敏,2%OVA溶液雾化吸入激发,建立哮喘模型。HE染色观察气道炎症情况；图像分析观察支气管管壁厚度；实时定量(Real-time)PCR测定肺组织中CaN mRNA水平；免疫组织化学法检测肺组织中CaN蛋白的表达；生物化学法检测大鼠肺组织CaN活性；流式细胞仪测定外周血单个核细胞细胞周期时相分布；ELISA法(酶联免疫吸附试验)测定血浆中IL-4、TNF-α的含量。结果：1.哮喘组大鼠支气管管壁厚度[(20.1190±2.4045)μm2／μm]较对照组[(13.0476±1.4327)μm2／μm]明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。2.哮喘组大鼠肺组织中CaNmRNA水平的相对表达(1.21-2.71)、CaN蛋白的相对表达量(0.3725±0.0586)及CaN的活性[(0.0588±0.0150)μmolPi/(mgprot·hour-1)]均较对照组[分别为(0.84-1.19)、(0.2407±0.0450)和(0.0379±0.0120)μmolPi/(mgprot·hour-1)]高,差异有统计学意义(分别P<0.05,P<0.01和P<0.01)。3.哮喘组大鼠血浆中IL-4、TNF-α的含量[分别为(327.5443±39.8024)pg／ml和(228.0855±60.1975) pg/ml]较对照组[分别为(223.3017±40.9510)pg/ml和(174.1766±33.0778) pg/ml]增加,差异有统计学意义(分别P<0.01和P<0.05)。4.哮喘组外周血单个核细胞G0／G1期百分率(90.0980±2.3468)%较对照组(95.1840±2.6970)%降低,S期、S+G2／M期百分率[分别为(7.3950±1.9028)%和(9.9020±2.3468)%]均较对照组[分别为(4.8160±2.6970)%和(3.2440±2.1460)%]增加,差异均有统计学意义(P均<0.01)。5.(1)大鼠肺组织CaN活性与大鼠支气管管壁厚度呈正相关(P<0.01),与处于S期、S+G2／M期的外周血单个核细胞百分率呈正相关(P均<0.05),与血浆中IL-4的含量亦呈正相关(P<0.05)；(2)血浆中IL-4含量与TNF-α含量及大鼠支气管管壁厚度亦呈正相关(P均<0.05)。结论：哮喘大鼠肺组织CaN的活性增加,其可能通过促进气道管壁增厚、外周血单个核细胞的增殖、活化及L-4和TNF-α的产生而参与哮喘气道重塑的形成。第二节哮喘大鼠肺组织Ca2+/CaN-NFATc活性及其与Th1／Th2失衡的关系目的：探究哮喘大鼠肺组织Ca2+/CaN-NFATc的活性及其与Th1／Th2失衡的关系。方法：20只Wistar大鼠随机分为哮喘组和对照组,每组10只。用10%OVA溶液致敏和2%OVA溶液雾化吸入激发,建立大鼠哮喘模型。HE染色观察气道炎症,图像分析测量气道管壁厚度；生物化学法检测肺组织钙含量、CaN活性；Western blotting法测定肺组织去磷酸化NFATc蛋白的表达及ELISA法测定IL-4、IL-2的含量。结果：1.哮喘组大鼠支气管管壁厚度[(20.1190±3.0795)μm2／μm]较对照组[(13.0476+2.0616)μm2/μm]支气管管壁厚度明显增加(P<0.01)。2.哮喘组大鼠肺组织中IL-4含量[(4.7309±0.2356)pg/ml]、IL-4／IL-2比值(1.1255±0.1092)分别较对照组[(3.4635±0.4468)pg/ml和(0.6649±0.0875)]增高,而哮喘组IL-2含量[(4.2251±0.2751)pg/ml]较对照组[(5.2161±03093)pg/ml]降低,差异有统计学意义(P均<0.01)。3.哮喘组CaN活性[(0.0560±0.0202)μmolPi/(mgprot·hour-1)]和去磷酸化NFATc蛋白的相对表达量(1.0685±0.0497)均较对照组[分别为(0.0362±0.0121)μmolPi/(mgprot·hour-1)和(0.6260±0.0377)]增加,差异有统计学意义(P均<0.01),哮喘组大鼠肺组织钙含量[(0.1497±0.0426)mmol/gprot]较对照组[(0.0796±0.0284)mmol/gprot]降低,差异有统计学意义(P<0.01)。4.(1)肺组织中CaN活性与去磷酸化NFATc蛋白的相对表达量呈正相关(P<0.05)；(2)肺组织中去磷酸化NFATc蛋白的相对表达量与IL-4／IL-2比值呈正相关(P<0.01)；(3)肺组织中IL-4／IL-2比值与大鼠支气管管壁厚度成正相关(P<0.01)。结论：哮喘大鼠肺组织中CaN-NFATc的活性增加,其活性的增加可促进IL-4／IL-2比值增加,推测CaN-NFATc信号通路可能参与了哮喘大鼠肺组织Th1/Th2失衡及气道重塑的形成。第三节Ca2+/CaN-NFATc信号通路在致敏大鼠淋巴细胞增殖、活化中的作用目的：探讨Ca2+/CaN-NFATc信号通路在致敏大鼠淋巴细胞增殖、活化中的作用。方法：30只Wistar大鼠随机分为对照组、致敏组和环孢菌素A(cyclosporinA, CsA)干预组,每组10只。致敏组和CsA干预组大鼠以10%OVA溶液腹腔注射致敏及2%OVA溶液雾化吸入激发,每天40分钟,共2周,末次激发后分离大鼠的脾淋巴细胞,加PHA-p(终浓度为5μg/ml)培养24小时。CsA干预组同时加入CsA稀释液(CsA终浓度为1.0μg/ml)。对照组以生理盐水代替OVA溶液致敏,余相同。生化法检测淋巴细胞CaN的活性；免疫细胞化学染色法检测淋巴细胞中去磷酸化NFATc蛋白的表达量；ELISA法测定细胞上清液中IL-4和IL-2的水平；流式细胞仪测定淋巴细胞内[Ca2+]i的浓度及淋巴细胞细胞周期各时相分布；Western blotting法测定淋巴细胞CyclinE蛋白的表达。结果：1.致敏组淋巴细胞内[Ca2+]的浓度(145.37±2.17)较对照组(123.34±5.44)高,差异有统计学意义(P<0.01)；CsA干预组(119.41±3.01)低于对照组和致敏组,差异有统计学意义(分别P<0.05,P<0.01)。2.致敏组淋巴细胞CaN的活性[(0.0844±0.0338)μmolPi/(mgprot·hour-1)]较对照组[(0.0587±0.0304)μmolPi/(mgprot-hour-1)]高,差异有统计学意义(P<0.05)；CsA干预组[(0.0324±0.0134)μmolPi/(mgprot·hour -1)]较对照组和致敏组均低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。3.致敏组淋巴细胞中去磷酸化NFATc蛋白的相对表达量(81.2080±14.3910)较对照组(63.6597±9.0225)高,差异有统计学意义(P<0.01)；CsA干预组(47.1932±7.1620)较对照组和致敏组均低,差异均有统计学意义(P均<0.01)。4.(1)致敏组细胞上清液中IL-4水平[(1.5488±0.1884)×10-2pg/ml]和IL4／IL2比值(0.8117±0.1153)均较对照组[分别为(0.9931±0.1208)×10-2pg／ml和(0.4899±0.4900)]高,差异有统计学意义(P均<0.01),而IL-2水平[(1.9165±0.1428)×10-2pg/ml]低于对照组[(2.0309±0.1803)×10-2pg/ml]但差异无统计学意义(P>0.05)；(2)CsA干预组细胞上清液中IL-4水平[(0.4687±0.0847)×10-2pg/ml]和IL-2水平[(0.6171±0.7132)×10-2pg/ml]分别低于对照组和致敏组,差异有统计学意义(P均<0.01),IL4／IL2比值(0.7762±0.1957)较对照组高,差异有统计学意义(P<0.01),而较致敏组减低,但差异无统计学意义(P>0.05)。5.致敏组处于G0／G1期淋巴细胞所占比例(89.3300±3.3850)%较对照组(94.1260±1.4389)%和CsA干预组(92.2100±1.9267)%减小(P均<0.01),而处于S期(7.8600±2.8241)%及S+G2／M期(10.6700±3.3850)%的淋巴细胞所占比例分别较对照组S期(1.7470±0.8545)%及S+G2／M期(5.8740±1.4389)%和CsA干预组S期(4.8600±1.959)%及S+G2／M期(7.9900±1.9405)%淋巴细胞所占比例增加(P均<0.01)；CsA干预组与对照组差别不大,差异无统计学意义(P＞0.05)。6.致敏组淋巴细胞中CyclinE蛋白的相对表达量(0.9327±0.0370)较对照组(0.8374±0.0637)高,差异有统计学意义(P6＜0.01)；CsA干预组(0.6840±0.0485)较对照组和致敏组均低,差异有统计学意义(P均<0.01)。7.(1)淋巴细胞内[Ca2+]i浓度与CaN的活性及CaN的活性与去磷酸化NFATc蛋白的相对表达量均呈正相关(分别P<0.01，P＜0.05)；(2)淋巴细胞中去磷酸化NFATc蛋白的相对表达量与上清液中IL-4的水平及淋巴细胞内CyclinE蛋白的相对表达量均呈正相关(分别P<O.01)。结论：致敏大鼠淋巴细胞Ca2+/CaN-NFATc信号通路的活性增加；其活性的增加可通过促进IL-4的产生和分泌,导致Thl／Th2失衡,也可通过促进CyclinE蛋白的表达而引起淋巴细胞的增殖。第二部分尼古丁对致敏大鼠淋巴细胞Ca2+/CaN-NFATc信号通路及淋巴细胞增殖和活化的影响目的：探讨尼古丁对致敏大鼠淋巴细胞增殖、活化及Thl／Th2失衡的影响以及可能的影响机制。方法：Wistar大鼠40只,用10%OVA溶液腹腔注射及2%OVA溶液雾化吸入激发使其致敏,每天40分钟,共2周,末次激发后分离大鼠的脾淋巴细胞,分组且分别予不同浓度的尼古丁刺激(终浓度分别为尼古丁0组：0μmol/L，尼古丁1组：1.0μmol/L,尼古丁2组：10μmol/L,尼古丁3组：100μmol/L),且每组分别加入PHA-p(终浓度为5μg／ml)培养24小时。ELISA法测定细胞上清液中IL-2、IL-4的水平,western blotting法测定淋巴细胞CyclinE蛋白及去磷酸化NFATc蛋白的表达,实时定量(Real-time)PCR检测淋巴细胞CyclinE mRNA的表达,流式细胞仪测定淋巴细胞的细胞周期分布及细胞内[Ca2+]1浓度,生物化学法检测淋巴细胞CaN活性。结果：1.(1)细胞上清液中IL-4的水平分别为尼古丁O组[(1.5527±0.2066)×10-2pg/ml]、尼古丁1组[(1.5287±0.0955)×10-2pg/ml]、尼古丁2组[(1.7903±0.1424)×10-2pg/ml]、尼古丁3组[(0.9234±0.2185)×10-2pg/ml],组间比较差异有统计学意义(P<0.01)；(2)细胞上清液中IL-2水平分别为尼古丁0组[(1.9041±0.1545)×10-2pg/ml]、尼古丁1组[(0.9183±0.0848)×10-2pg/ml]、尼古丁2组[(0.7943±0.0642)×10-2pg／ml]、尼古丁3组[(0.6567±0.0790)×10-2 pg/ml],组间比较差异有统计学意义(P<0.01)；(3)细胞上清液中IL-4／IL-2比值分别为尼古丁0组(0.8196±0.1254)、尼古丁1组(1.6843±0.2497)、尼古丁2组(2.2670±0.2631)、尼古丁3组(1.4149±0.3372),组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。2.(1)淋巴细胞中CyclinE mRNA的相对表达分别为尼古丁0组(1.0794±0.4809)、尼古丁1组(1.6287±0.3123)、尼古丁2组(2.3411±0.3802)、尼古丁3组(0.6182±0.2401),组间比较差异有统计学意义(P<0.01)；(2)淋巴细胞中CyclinE蛋白的相对表达量分别为尼古丁0组(0.9408±0.0145)、尼古丁1组(0.9755±0.0082)、尼古丁2组(1.2757±0.0701)、尼古丁3组(0.9242±0.0123),组间比较差异有统计学意义(P<0.01)；(3)淋巴细胞细胞周期G0／G1期百分率分别为尼古丁0组(89.3300±3.3850)%、尼古丁1组(83.8670±3.4977)%、尼古丁2组(77.9480±2.7949)%、尼古丁3组(89.8280±3.400)%,组间比较差异有统计学意义(P<0.01)；S期和S+G2／M期百分率分别为尼古丁0组[(7.8600±2.8241)%和(10.6700±3.3850)%]、尼古丁1组[(10.9170±3.1836)%和(15.9330±3.81453)%]、尼古丁2组[(14.2100±2.6690)%和(22.0520±2.7949)%]、尼古丁3组[(7.5510±2.3390)%和(10.1720±3.4004)%],组间比较差异均有统计学意义(P均<0.01)。3.(1)淋巴细胞中[Ca2+]i浓度分别为尼古丁0组(145.3720±2.1747)、尼古丁1组(151.9470±3.2908)、尼古丁2组(157.1350±4.8537)、尼古丁3组(132.1750±3.8274),组间比较差异有统计学意义(P<0.01)；(2)淋巴细胞中CaN的活性分别为尼古丁0组[(0.0844±0.0338)μmolPi／(mgprot·hour-1)]、尼古丁1组[(0.2493±0.0568)μmolPi／(mgprot·hour-1)].尼古丁2组[(0.3203±0.0924)μmolPi／(mgprot·hour-1)].尼古丁3组[(0.1788±0.0728)μmolPi／(mgprot-hour-1)],组间比较差异有统计学意义(P<0.01)；(3)淋巴细胞中去磷酸化NFATc蛋白的相对表达量分别为尼古丁0组(0.8379±0.0132)、尼古丁1组(0.9655±0.0144)、尼古丁2组(1.1011±0.0306)、尼古丁3组(0.8973±0.0167),组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。4.(1)淋巴细胞中[Ca2+]浓度与CaN的活性及CaN的活性与去磷酸化NFATc蛋白的相对表达量均呈正相关(P均<0.01)；(2)淋巴细胞中去磷酸化NFATc蛋白的相对表达量与细胞上清液中IL4／IL2的比值及细胞中CyclinE蛋白的相对表达量均呈正相关(P均<0.01)。结论：(1)尼古丁浓度在0-10μmol／L范围内时,致敏大鼠淋巴细胞上清液中IL-4的水平及IL-4／IL-2比值随尼古丁浓度增加而增加,而IL-2水平随尼古丁浓度增加而渐减少；而尼古丁浓度为100μmol／L时,细胞上清液中IL-4水平、IL-2水平及IL-4／IL-2比值均显著减少。(2)尼古丁浓度在0-10μmol／L范围内时,可使致敏大鼠淋巴细胞中CyclinE mRNA和CyclinE蛋白水平的表达渐增加,使处于DNA合成期和细胞分裂前期的淋巴细胞比例显著增加,促进了淋巴细胞的增殖,且呈浓度依赖性；尼古丁浓度为100μmol／L时,反而显著抑制了致敏大鼠淋巴细胞中CyclinE mRNA和CyclinE蛋白水平的表达,抑制了其淋巴细胞的增殖。(3)尼古丁浓度在0-10μmol/L范围内时,致敏大鼠淋巴细胞中[Ca2+]i浓度渐增加,CaN的活性渐增加,去磷酸化NFATc蛋白的相对表达量亦渐增加,即淋巴细胞Ca2+／CaN-NFATc的活性随尼古丁浓度的增加而增加；而100μmol／L尼古丁反而显著抑制了致敏大鼠淋巴细胞Ca2+／CaN-NFATc的活性。(4)淋巴细胞Ca2+／CaN-NFATc活性的改变可影响淋巴细胞的增殖、活化及细胞因子的产生。总之,此部分实验结果说明尼古丁可能通过影响致敏大鼠淋巴细胞Ca2+／CaN-NFATc的活性而影响其淋巴细胞的增殖、活化和Thl/Th2的失衡。