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分枝杆菌NwIB-02是一株能够转化植物甾醇同时生成雄甾烯二酮AD和ADD的菌株，有一定应用前景。但AD与ADD结构相似，在工业生产中很难进行分离，这成为该菌的重要缺陷。本论文的研究设想是构建能够积累高纯度ADD的基因工程菌，我们分别从分枝杆菌NwIB-02和简单节杆菌中，获得并鉴定了主要负责AD向ADD转化的3-甾酮-△1-脱氢酶基因(ksddM和ksddA)，通过在分枝杆菌NwIB-02中进行强化表达，最终成功构建了多株具有重要应用前景的ADD生产工程菌株。具体内容如下：
从分枝杆菌NwIB-02中克隆得到一段ksdd保守序列(1148 bp)，通过染色体步移，获得ksdd完整的开放阅读框(ksddM)，大小为1701 bp，与Mycobacterium smegmatis str.MC2155(Genbank CP000480)ksdd的序列一致性为82％。ksddM基因(GenBankGQ228843)编码566 aa，分子量60949.5 D，理论等电点8.67。经软件分析发现KSDDM存在2个跨膜区段，4次穿膜螺旋，接近N末端有一个很强的穿膜结构域，这表明KSDDM很可能是膜蛋白。同时，从简单节杆菌中获得模式ksdd基因(ksddA)。
通过质粒pET-22b(+)和pET-32a-c(+)实现了ksddM在E.coli BL21(DE3)中的异源表达。pET-22b(+)表达目标蛋白的量很低，且主要以包涵体的形式存在；pET-32a-c(+)表达目标蛋白的量高，表达量占全菌蛋白的50％以上，可溶性部分占25％左右。以分光光度法检测KSDDM的酶活，pET-22b(+)所表达的KSDDM酶活为35.29 mU/mg蛋白，约为原始菌株酶活的3倍；pET-32a-c(+)所表达的KSDDM酶活为25.67 mU/mg蛋白，约为原始菌株酶活的2倍。
为了获得积累高纯度ADD的基因工程菌株，以分枝杆菌NwIB-02为出发菌株，通过分枝杆菌表达载体pMV261和整合载体pMV306，分别用ksddM和ksddA来强化分枝杆菌NwIB-02的KSDD活性，成功构建了pMV261-ksddM(NwIB-03)、pMV306-ksddM(NwIB-04)、pMV261-ksddA(NwIB-05)和pMV306-ksddA(NwIB-06)四株基因重组菌株。在摇瓶中按0.4 g/L的植物甾醇添加量进行转化反应，反应240 h时原始分枝杆菌NwIB-02产物ADD的生成量为0.08918g/L，纯度为68.94％。四株基因工程菌株在底物转化率及产物纯度方面均有明显提高，其中尤以NwIB-04和NwIB-05的改善最为显著，ADD的生成量分别为0.1401g/L和0.1740g/L(较原始菌株提高95.1％)，纯度分别为98.34％和98.60％。
以上工作为利用基因工程菌株进行工业化生产ADD奠定了重要基础。