背景和目的胃癌是世界上第二位常见的恶性肿瘤,在我国其死亡率则高居恶性肿瘤死亡率之首,已严重威胁着人们的生命与健康。对于早期胃癌患者,术后预后尚好。在我国,2/3患者确诊时已属中晚期,丧失了根治性手术治疗的机会,主要采取以化疗为主的治疗方案,但总体疗效仍不理想,其主要原因是由于胃癌细胞的多药耐药现象导致化疗失败所致。目前,我们对胃癌细胞多药耐药机制的认识还不十分清楚。因此,深入探讨胃癌细胞的耐药机制十分必要。研究发现,内质网应激反应作为细胞的保护性机制可能参与耐药。但对内质网应激与胃癌细胞耐药的关系及其耐药机理知之甚少。为更好地模拟机体内组织细胞的生长环境,本研究拟建立胃癌细胞的三维培养体系,并利用二维及三维细胞培养体系探讨内质网应激诱导胃癌细胞对化疗药物产生耐药的机制,为阐明内质网应激介导胃癌细胞耐药的机理提供实验依据,为胃癌治疗提供新的治疗靶点。本课题将从三个部分对内质网应激诱导胃癌细胞耐药的机制展开研究。第一部分：内质网应激诱导胃癌细胞对化疗药物产生耐药第一阶段：建立胃癌细胞内质网应激模型方法用衣霉素或毒胡萝卜素分别处理胃癌细胞BGC823及SGC7901 0h、8h、16h及24h,Western blot技术检测各时间点GRP78在蛋白水平的表达；用衣霉素或毒胡萝卜素分别处理胃癌细胞BGC823及SGC7901 0h及8h, RT-PCR技术检测GRP78的1nRNA表达。结果1.与Oh组相比,衣霉素或毒胡萝卜素处理胃癌细胞BGC823及SGC7901 8h、16h及24h后,GRP78蛋白表达量均明显增高(P<0.05)。2.与对照组相比,衣霉素或毒胡萝卜素处理胃癌细胞BGC823及SGC7901 8h后,GRP78 mRNA表达量均明显增加(P<0.05)第二阶段探讨内质网应激可否诱导胃癌细胞耐药方法将胃癌细胞BGC823及SGC7901分组：未加药对照组、衣霉素(或毒胡萝卜素)组、顺铂组、衣霉素(或毒胡萝卜素)+顺铂组、多柔比星组及衣霉素(或毒胡萝卜素)+多柔比星组,流式细胞仪技术检测各组细胞凋亡率。结果1.对照组、衣霉素组、顺铂组、衣霉素+顺铂组、多柔比星组及衣霉素+多柔比星组,胃癌细胞BGC823的凋亡率分别为2.1%±0.5%、11.2%±1.3%、35.9%±1.4%、18.8%±1.6%、41.5%±2.1%及22.7%±1.7%。与对照组相比,各药物处理组细胞凋亡率均明显增高(P<0.05)；与顺铂组相比,衣霉素+顺铂组凋亡率明显下降(P<0.05)；与多柔比星组相比,衣霉素+多柔比星组凋亡率明显下降(P<0.05)。2.对照组、衣霉素组、顺铂组、衣霉素+顺铂组、多柔比星组及衣霉素+多柔比星组,胃癌细胞SGC7901的凋亡率分别为1.6%±0.4%、10.2%±1%、36%±1.5%、21.8%±1.3%、42.2%±2%及24.4%±1%。与对照组相比,各药物处理组细胞凋亡率均明显增高(P<0.05)；与顺铂组相比,衣霉素+顺铂组凋亡率明显下降(P<0.05)；与多柔比星组相比,衣霉素+多柔比星组凋亡率明显下降(P<0.05)。3.对照组、毒胡萝卜素组、顺铂组、毒胡萝卜素+顺铂组、多柔比星组及毒胡萝卜素+多柔比星组,胃癌细胞BGC823的凋亡率分别为2.8%±0.6%、8.7%±1%、32%±1.4%、20.4%±1.5%、46%±3.2%及22.7%±1.8%。与对照组相比,各药物处理组细胞凋亡率均明显增高(P<0.05)；与顺铂组相比,毒胡萝卜素+顺铂组凋亡率明显下降(P<0.05)；与多柔比星组相比,毒胡萝卜素+多柔比星组凋亡率明显下降(P<0.05)4.对照组、毒胡萝卜素组、顺铂组、毒胡萝卜素+顺铂组、多柔比星组及毒胡萝卜素+多柔比星组,胃癌细胞SGC7901的凋亡率分别为2.1%±0.5%、9.4%±1.1%、32%±0.9%、21.3%±0.9%、39.8%+2.6%及25.1%±1.6%。与对照组相比,各药物处理组细胞凋亡率均明显增高(P<0.05)；与顺铂组相比,毒胡萝卜素+顺铂组凋亡率明显下降(P<0.05)；与多柔比星组相比,毒胡萝卜素+多柔比星组凋亡率明显下降(P<0.05)。第二部分：P38在内质网应激诱导胃癌细胞对化疗药物产生耐药中的作用第一阶段：探讨内质网应激可否激活P38 MAPK方法以衣霉素或毒胡萝卜素分别处理胃癌细胞BGC823及SGC7901 0h、8h、16h及24h,Western blot技术检测各时间点P38及磷酸化P38 (phospho-P38,p-P38)的表达。结果与0h组相比,衣霉素或毒胡萝卜素处理胃癌细胞BGC823及SGC7901 8h、16h及24h后,P38的磷酸化水平均明显增高(P<0.05),各组P38蛋白表达水平无明显变化。第二阶段：明确磷酸化P38抑制剂的抑制效果方法将胃癌细胞BGC823分组：未加药对照组、衣霉素组、SB203580(或PD169316)+衣霉素组。Western blot技术检测各组P38及p-P38的表达。结果1.衣霉素组胃癌细胞系BGC823的P38磷酸化水平明显高于对照组及SB203580+衣霉素组(P<0.05)；而SB203580+衣霉素组P38磷酸化水平与对照组无明显差别(P>0.05)。2.衣霉素组胃癌细胞系BGC823的P38磷酸化水平明显高于对照组及PD169316+衣霉素组(P<0.05)；而PD169316+衣霉素组P38磷酸化水平与对照组无明显差别(P>0.05)。第三阶段：探讨P38在内质网应激诱导胃癌细胞耐药中的作用方法将胃癌细胞BGC823分组：未加药对照组、SB203580(或PD169316)组、衣霉素组；SB203580(或PD169316)+衣霉素组、顺铂组、SB203580(或PD169316)+顺铂组、衣霉素+顺铂组、SB203580(或PD169316)+衣霉素+顺铂组、多柔比星组、SB203580(或PD169316)+多柔比星组、衣霉素+多柔比星组、SB203580(或PD169316)+衣霉素+多柔比星组,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。结果1.对照组、SB203580预处理组、衣霉素预处理组、SB203580+衣霉素组、顺铂组、SB203580+顺铂组、衣霉素+顺铂组、SB203580+衣霉素+顺铂组、多柔比星组、SB203580+多柔比星组、衣霉素+多柔比星组及SB203580+衣霉素+多柔比星组,BGC823的细胞凋亡率分别为：3%±0.6%、8.3%±0.9%、9.7%±1.3%、22.5%±2.6%、36.3%±2.4%37.9%±1.4%、19.3%±1.8%、38.9%±2.6%、40%±2.1%、42.5%±2.2%、21.1%±1.9%及44.9%±2.7%。各药物处理组细胞凋亡率均明显高于对照组(P<0.05)；SB203580+顺铂组细胞凋亡率明显高于SB203580预处理组(P<0.05),但SB203580与顺铂并无协同效应(P>0.05)；衣霉素+顺铂组细胞凋亡率明显低于顺铂组(P<0.05)；SB203580+衣霉素+顺铂组细胞凋亡率明显高于衣霉素+顺铂组(P<0.05),但与顺铂组无明显差别(P>0.05)；SB203580+多柔比星组细胞凋亡率明显高于SB203580预处理组(P<0.05),但SB203580与多柔比星并无协同效应(P>0.05)；衣霉素+多柔比星组细胞凋亡率明显低于多柔比星组(P<0.05)；SB203580+衣霉素+多柔比星组细胞凋亡率比衣霉素+多柔比星组明显提高(P<0.05),但与多柔比星组无明显差别(P>0.05)2.对照组、PD169316预处理组、衣霉素预处理组、PD169316+衣霉素组、顺铂组、PD169316+顺铂组、衣霉素+顺铂组、PD169316+衣霉素+顺铂组、多柔比星组、PD169316+多柔比星组、衣霉素+多柔比星组及PD169316+衣霉素+多柔比星组,BGC823的细胞凋亡率分别为：1.8%±0.3%、7.3%±1%、11.3%±0.9%、20.2%±1.6%、37.9%±2.3%、38.8%+1.7%、18.3%±1.2%及40.3%±2.4%。各药物处理组细胞凋亡率均明显高于对照组(P<0.05)；PD169316+顺铂组细胞凋亡率明显高于PD169316预处理组(P<0.05),但PD169316与顺铂并无协同效应(P>0.05)；衣霉素+顺铂组细胞凋亡率明显低于顺铂组(P<0.05)；PD169316+衣霉素+顺铂组细胞凋亡率比衣霉素+顺铂组明显提高(P<0.05),但与顺铂组无明显差别(P>0.05)；PD169316+多柔比星组细胞凋亡率明显高于PD169316预处理组(P<0.05),但PD169316与多柔比星并无协同效应(P>0.05)；与多柔比星组相比,衣霉素+多柔比星组细胞凋亡率明显下降(P<0.05)；PD169316+衣霉素+多柔比星组细胞凋亡率比衣霉素+多柔比星组明显提高(P<0.05),但与多柔比星组无明显差别(P>0.05)。第三部分：三维细胞培养体系中内质网应激诱导胃癌细胞对化疗药物产生耐药的机制第一阶段：建立胃癌细胞三维培养体系方法用胃癌细胞BCG823建立以胶原混合液为依托的三维细胞培养体系,普通光学显微镜观察并比较二维及三维培养体系下细胞的生长情况；1ive/dead双荧光试剂标记二维及三维培养体系下的存活及死亡细胞,荧光显微镜观察结果。结果1.普通光学显微镜观察结果显示：贴壁培养BGC823细胞形态呈多边形,单层生长；将BGC823细胞悬液培养于用琼脂预处理的培养板内24h-48h,细胞聚集成类球体,生长于琼脂上方；将琼脂上的BGC823类球体移至胶原混合液中继续生长24h-48h,可见类球体生长于胶原凝胶中,且有部分细胞从类球体边缘向胶原凝胶中迁移。2.荧光显微镜观察结果：贴壁培养BGC823细胞形态呈多边形,死细胞少,细胞生长状态良好；生长于琼脂上的类球体内死细胞少,绝大多数细胞生长状态良好；生长于胶原凝胶中的BGC823类球体内部细胞生长状态良好,且有部分细胞从类球体边缘向胶原凝胶中迁移。第二阶段：探讨三维细胞培养体系中药物的通透性方法用两种结构不同,但均能产生自发荧光的药物U0126及多柔比星处理生长于胶原凝胶中BGC823胃癌细胞类球体2h、6h、24h及48h,普通荧光显微镜观察类球体内荧光强度。用U0126处理BGC823胃癌细胞类球体24h,共聚焦显微镜观察类球体内荧光的分布。结果1.普通荧光显微镜观察结果显示：在BGC823类球体培养基中加入可产生荧光的药物U0126或多柔比星2h、6h、24h及48h时,均可在类球体中看到UO126产生的绿色荧光及多柔比星产生的红色荧光。2.共聚焦显微镜观察结果显示：BGC823类球体培养基中加入可产生荧光的药物U0126 24h时,在类球可中央可见U0126产生的绿色荧光。提示BGC823类球体对药物有较好的通透性,使药物可顺利到达类球体中央。第三阶段：三维细胞培养体系中探讨内质网应激诱导胃癌细胞对化疗药物产生耐药的机制方法将生长于胶原混合物内的BGC823胃癌细胞类球体分组：未加药对照组、多柔比星组、衣霉素+多柔比星组、SB203580+衣霉素+多柔比星组,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。结果对照组、多柔比星组、衣霉素+多柔比星组、SB203580+衣霉素+多柔比星组,BGC823的细胞凋亡率分别为：2.9%±0.7%、36.4%±2.3%、17.9%±2%及39.3%±2.6%。与对照组相比,各药物处理组细胞凋亡率均明显增高(P<0.05)；与多柔比星组相比,衣霉素+多柔比星组细胞凋亡率明显下降(P<0.05)；SB203580+衣霉素+多柔比星组细胞凋亡率比衣霉素+多柔比星组明显提高(P<0.05),但与多柔比星组无明显差别(P>0.05)结论1.衣霉素及毒胡萝卜素均能诱导胃癌细胞BGC823及SGC7901发生内质网应激反应。2.建立了以胶原混合物为依托的胃癌细胞BGC823的三维培养体系,证实该体系对药物有良好的通透性。3.在二维及三维培养体系下,内质网应激均可通过激活P38通路诱导胃癌细胞对化疗药物顺铂及多柔比星产生耐药,阻断该通路可基本抑制内质网应激诱导胃癌细胞对化疗药物的耐药现象。