核酸(DNA和RNA)作为生命活动最重要的物质基础,在生命系统中起着极为重要的作用。维持基因组结构的完整性对于生命体发挥生物功能是非常重要的,也对有机体起着主要作用。在理化等因素作用下,DNA复制过程中容易产生基错配或者诱导DNA突变。为了确保基因完整性,细胞产生了大量与核酸切除修复有关的核酸酶类,它们能将DNA中的错配碱基通过多种方式进行切除修复,来确保核酸复制过程的高保真性,从而有效防止碱基错配引发的疾病。因此,关于核酸酶的活性研究一直是研究人员关注的焦点。迄今为止已建立了多种可用于核酸酶活性研究的检测。然而如何快速、简单、灵敏、高通量实现核酸酶活性分析仍是目前尚待解决的难题。随着新型二维纳米材料Ⅷ氧化石墨烯(Graphene Oxide)的出现,这种能特异性吸附DNA分子且具有优良理化性能的材料有望在酶促反应中获得广泛应用。为此,本论文将这种新型纳米材料Ⅷ氧化石墨烯引入到酶促生物传感器的研究中。利用其差别性吸附DNA链的能力以及荧光猝灭率高等优点,开展了简单、快速、灵敏的核酸酶生物传感体系构建及其应用研究。主要内容如下:1.基于氧化石墨烯和猝灭的DNA发夹探针发展了一种定量检测DNase Ⅰ活性的新型荧光检测方法。在优化反应体系的Mg2+、温度和pH值对DNase Ⅰ检测影响基础上,利用最佳反应体系开展DNase Ⅰ的活性分析,检测下限为0.005 U mL-1;为了进一步拓宽该方法的实用性,我们利用该方法考察了重金属离子和抗生素对DNase Ⅰ酶酶促反应的影响。实验结果发现:重金属离子对DNase I酶的活性表现出浓度依赖性抑制效应,其IC50值分别为0.04μg/mL(Hg2+),0.10μg/mL(Pb2+),1.35 μg/mL(Cd2+),1.20 μg/mL(As3+)和 1.80μg/mL(Cu2+)。抗生素检测结果发现:硫酸庆大霉素是一种抑制DNase Ⅰ酶活性的抗生素药物,其IC50值为0.57±0.12 μM。最后,将新方法用于肿瘤样品中的DNase Ⅰ活性分析,结果显示肺癌组织中的DNase Ⅰ酶活性高于癌旁组织。以上结果表明:本章建立的新方法有望在生物样品中的DNase Ⅰ酶高通量检测和体外药物筛选中获得广泛应用。2.在前一章建立的DNase Ⅰ活性分析方法的基础上,我们结合天然药物分离技术,从体外和细胞水平上进一步开展天然药物与DNase Ⅰ的相互作用研究。首先利用萃取法从青钱柳叶片分离得到了 11种小分子药物,利用建立的DNase ⒈活性分析技术考察溶液中的小分子药物对DNase Ⅰ活性影响,结果表明:在考察的药物中7种具有不同程度促进酶促活性的功能,其余4种表现出对酶活性的抑制作用。以3种药物(两种激活剂和1种抑制剂)为材料,从细胞水平上考察了药物处理对细胞内DNaseⅠ活性水平的影响,发现结果:Schisanlactone E和SBB-L-1具有抑制MCF-7细胞中的DNase Ⅰ酶活性功能,药物浓度为20 μM时DNaseⅠ活性分别降低57%和61%;20 μM的药物Schisanlactone E的处理能分别诱导BEL-7404和SMMC-7721细胞系中的DNase Ⅰ酶活性提高28%和33%。以上结果表明小分子药物在不同水平上差异性调节DNase Ⅰ的活性。3.以氧化石墨烯猝灭荧光探针为工具,开展了 S1核酸酶酶促反应的实时监测,热动力学考察和体外抑制剂筛选研究。结果表明:这种可实时监测S1核酸酶酶促反应的新方法检测下限为0.5 U/ml,其动力学参数Km和kcat值分别为1.4±0.12 μM和0.6 min-1。用于抗生素筛选结果发现:青霉素钠盐、羧苄青霉素二钠和氨苄青霉素具有抑制S1核酸酶活性的作用,浓度为2 mM时S1核酸酶活性分别降低60%,61%和66%。以上结果表明:这种基于氧化石墨烯猝灭探针构建的S1核酸酶活性监测平台可用于酶促活性分析和抗生素筛选。