脑缺血疾病是严重危害人类健康的疾病之一。神经细胞对缺血性危害极为敏感,如果缺血时间较长,神经细胞会大量死亡,即使恢复血液供应,神经细胞也难以再生,甚至会留下严重的后遗症。随着对脑缺血疾病研究的深入,脑缺血耐受(brain ischemic tolerance, BIT)现象越来越普遍受到关注。实验发现,给动物突然造成较严重的脑缺血后,海马CA1区的神经元会大量死亡。若在此之前,预先给动物造成轻微、短时、不至于引起神经元死亡的脑缺血,间隔一定时间后,再给动物造成较严重的、通常会引起大量神经元死亡的脑缺血,此时海马CA1区的神经元则基本不死亡,即神经元对缺血性损害产生了抵抗力,这一现象被称为脑缺血耐受。预先给予的轻微、短时脑缺血称为脑缺血预处理(cerebral ischemic preconditioning,CIP)。阐明脑缺血预处理脑保护作用的发生机制,对临床上研究、开发提高神经元对缺血缺氧耐受性的治疗方法具有重要意义。各种疾病引起的脑组织缺血、缺氧均可引起神经元能量代谢障碍,抑制Na+/K+依赖式ATP酶的活动,使细胞外K+浓度明显增高,Na+浓度相应降低,导致神经元去极化,引起兴奋性神经末梢释放谷氨酸;此外,细胞外高K+能够逆转高亲合力谷氨酸转运体的活动,把谷氨酸从细胞内转运至细胞外。这些原因引起细胞外谷氨酸等兴奋性氨基酸增多。这些增多的谷氨酸与神经细胞膜相应的受体结合,引起Na+、Ca2+内流以及细胞内Ca2+释放,导致Na+、Ca2+超载,进而使神经细胞死亡。因此,将这些氨基酸称为兴奋性神经毒素。降低脑缺血时细胞外液中谷氨酸的浓度,减少其与突触后膜特异性受体的结合,是防治其兴奋性毒性作用、减轻缺血时神经元损伤的重要手段。兴奋性氨基酸转运体(excitatory amino acid transports, EAATs)是调控脑内细胞外液谷氨酸浓度的重要机制。其中星形胶质细胞谷氨酸转运体亚型GLT-1在终止谷氨酸能神经传递,维持细胞外液谷氨酸浓度处于正常水平方面发挥重要作用。一些研究对星形胶质细胞GLT-1在缺血缺氧耐受中的作用给予了关注。例如,Douen等研究表明,皮层扩散性抑制预处理可以下调星形胶质细胞谷氨酸转运体(EAAT1和EAAT2)的表达,防止缺血引起的谷氨酸逆转运;Romera等应用离体(in vitro)模型发现,缺血或缺氧预处理可以使谷氨酸转运体表达增加。这些结果提示GLT-1可能与脑缺血耐受有关。但星形胶质细胞GLT-1在整体情况下(in vivo)是否参与CIP的脑保护作用?调制GLT-1是否可增强脑细胞对缺血性损害的耐受性?等尚未见报道。因此,本实验应用大鼠全脑缺血模型、GLT-1抑制剂Dihydrokainate (DHK)、GLT-1反义及正义寡核苷酸,在整体水平探讨调制GLT-1对脑缺血耐受诱导的影响,为阐明GLT-1在脑缺血耐受形成中的作用提供实验依据。1 DHK抑制GLT-1的功能阻断CIP诱导的脑缺血耐受应用大鼠四血管闭塞(4-vessel occlusion,4VO)全脑缺血模型,观察GLT-1特异性抑制剂DHK对CIP脑保护作用的影响,探讨GLT-1在脑缺血耐受中的作用。将96只凝闭双侧椎动脉2d后的Wistar大鼠随机分为8组:①sham组(n=6):只暴露双侧颈总动脉,不阻断血流;②CIP组(n=6):夹闭双侧颈总动脉3 min;③脑缺血打击组(n=6):夹闭双侧颈总动脉8 min;④CIP+脑缺血打击组(n=6):夹闭双侧颈总动脉3 min作为CIP,再灌注2 d后再夹闭双侧颈总动脉8 min;⑤双蒸水组(n=6):右侧脑室注射双蒸水20μl;⑥DHK组(n=30):右侧脑室注射DHK溶液20μl,根据DHK的剂量进一步分为10、100、200、500和1000 nmol 5个亚组,每组6只动物;⑦DHK+CIP组(n=18):右侧脑室注射DHK溶液20μl,20 min后夹闭双侧颈总动脉3 min,根据DHK的剂量进一步分为10、100和200 nmol 3个亚组,每组6只动物;⑧DHK+CIP+脑缺血打击组(n=18):右侧脑室注射DHK溶液20μl ,20 min后夹闭双侧颈总动脉3 min,2 d后夹闭双侧颈总动脉8 min。根据DHK剂量不同分为10、100、200 nmol 3个亚组,每组6只动物。以上各组动物于sham手术、侧脑室注射或末次脑缺血后7 d断头取脑,常规脑组织切片(5μm厚),硫堇染色,光学显微镜下观察海马CA1区组织学形态,确定锥体神经元迟发性死亡(delayed neuronal death, DND)情况。计数海马CA1区每1 mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目,每张切片双侧海马各计数3个区段取平均数为神经元密度(Neuronal density, ND)。根据以下标准确定组织学分级(Histological grade, HG):0级,无神经元死亡;Ⅰ级,散在神经元死亡;Ⅱ级,成片神经元死亡;Ⅲ级,几乎全部的神经元死亡。结果发现,4VO过程中,大鼠翻正反射消失,瞳孔散大,脑电波频率变慢,波幅逐渐变小甚至成等电位线,说明产生了全脑缺血。硫堇结果显示,Sham组和CIP组大鼠海马CA1区无明显的DND,HG为0～Ⅰ级,ND值分别为208.25±5.97和202.93±4.32。脑缺血打击组大鼠海马CA1区出现明显的DND,与sham组和CIP组相比,HG(Ⅱ～Ⅲ级)明显升高(P<0.01),ND值(45.86±21.93)显著降低(P<0.01)。CIP+脑缺血打击组海马CA1区DND不明显,与脑缺血打击组相比,HG(0～Ⅰ级)明显降低(P<0.01),ND值(208.07±5.87)显著升高(P<0.01),表明CIP可以诱导海马CA1区神经元产生缺血性耐受,对抗缺血打击引起的DND。右侧脑室注射双蒸水后海马CA1区组织形态与Sham组和CIP组基本一致。单纯侧脑室给予DHK组中,10、100、200 nmol剂量组海马CA1区神经元少量死亡,三组的HG均为Ⅰ级,ND值分别为172.76±17.31、162.64±6.12和155.43±9.82;而500、1000 nmol剂量组的HG分别为为Ⅱ级和Ⅲ级,ND值分别为105.35±3.84和6±1.39;与10、100、200 nmol组相比,HG和ND的变化具有显著性(P<0.05),表明大剂量的DHK可引起显著的海马CA1区锥体神经元死亡。因此,以下各组中,仅观察DHK 10、100和200 nmol的影响。DHK+CIP组中海马CA1区组织形态与Sham组和CIP组基本一致(10、100和200 nmol组HG均为为0～Ⅰ级,ND值分别为192.15±6.25、188.65±3.90和191.35±3.88)。DHK+CIP+脑缺血打击组中,大鼠海马CA1区出现了显著的DND,随着DHK剂量的增加,其HG级逐渐升高(10 nmol组为Ⅰ级,100 nmol组为Ⅰ～Ⅱ级,200 nmol组为Ⅲ级),ND逐渐下降(10 nmol组为160.87±13.55,100 nmol组为117.07±10.11,200 nmol组为4.87±2.02);与CIP+脑缺血打击组相比,上述HG和ND的变化具有显著性(P<0.01);此外,与单独DHK组相比,DHK+CIP+脑缺血打击组的DHK的量效曲线明显左移,并且斜率变陡。这些结果表明,DHK+CIP+脑缺血打击组中,除去DHK本身引起的少量神经元死亡以外,DHK还阻断CIP抗脑缺血打击的作用,从而引起更多的锥体细胞死亡。以上结果表明, GLT-1特异性抑制剂DHK可剂量依赖性地阻断CIP抗脑缺血打击的作用,提示GLT-1参与CIP诱导的脑缺血耐受。2 GLT-1反义寡核苷酸抑制GLT-1表达减弱CIP抗脑缺血打击的作用应用GLT-1反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,AS-ODNs)抑制GLT-1蛋白的表达,观察其对CIP抗脑缺血打击作用的影响,进一步探讨GLT-1在脑缺血耐受中的作用。2.1 GLT-1 AS-ODNs对GLT-1蛋白表达的影响将42只凝闭双侧椎动脉36 h的Wistar大鼠随机分为3组:①对照组(n=6):右侧脑室注射双蒸水5μl,注射后12 h取材;②AS-ODNs 9 nmol组(n=18):右侧脑室注射AS-ODNs溶液5μl(9 nmol),根据AS-ODNs注射后取材的时间又分为三个亚组:12 h、24 h、36 h组;③AS-ODNs 18 nmol组(n=18):右侧脑室注射AS-ODNs溶液5μl(18 nmol),根据AS-ODNs注射后取材的时间又分为三个亚组:12 h、24 h、36 h组。所有大鼠在预定时间断头取材,低温条件下分离海马CA1区,采用Western blotting方法测定GLT-1的蛋白表达,应用凝胶图像分析系统对Western免疫反应阳性条带进行积分光密度(integrated optical density,IOD)测定,以GLT-1的IOD值与β-actin的IOD值的比值代表GLT-1表达的相对水平。结果显示,双蒸水对照组的IOD的比值为0.65±0.22。注射AS-ODNs 9 nmol组中,12 h组的IOD比值为0.37±0.07,24 h组为0.20±0.05, 36 h组为0.25±0.07。注射AS-ODNs 18 nmol组中,12 h组的IOD比值为0.11±0.05,24 h组为0.05±0.02,36 h组为0.17±0.16。与双蒸水对照组相比,注射AS-ODNs后IOD的比值显著降低(P<0.05),且呈现一定的剂量依赖性。以上结果表明,侧脑室注射AS-ODNs溶液可以剂量依赖性地抑制GLT-1蛋白表达,这种抑制作用在注射AS-ODNs后24 h最为显著。2.2 GLT-1 AS-ODNs抑制CIP对海马CA1区锥体神经元的保护作用将54只凝闭双侧椎动脉的Wistar大鼠随机分为7组:①sham组(n=6):只暴露双侧颈总动脉,不阻断血流;②CIP组(n=6):夹闭双侧颈总动脉3 min;③脑缺血打击组(n=6):夹闭双侧颈总动脉8 min;④CIP+脑缺血打击组(n=6):夹闭双侧颈总动脉3 min作为CIP,再灌注2 d后再夹闭双侧颈总动脉8 min。⑤双蒸水组(n=6):于分离暴露双侧颈总动脉(但不夹闭)前12 h、后12 h及后36 h右侧脑室注射双蒸水,每次5μl,其他同sham组;⑥AS-ODNs组(n=12):于分离暴露双侧颈总动脉(但不夹闭)前12 h、后12 h及后36 h右侧脑室注射AS-ODNs溶液,每次5μl,其他同sham组。根据AS-ODNs的剂量进一步分为9和18 nmol 2个亚组,每组6只动物;⑦AS-ODNs+CIP+脑缺血打击组(n=12):于CIP前12 h、后12 h及后36 h右侧脑室注射AS-ODNs溶液,每次5μl,其它同CIP+脑缺血打击组。根据AS-ODNs的剂量进一步分为9 nmol和18 nmol 2个亚组,每组6只动物。以上各组动物均在sham手术、侧脑室注射或末次脑缺血后7d断头取材,常规脑组织切片(5μm厚),硫堇染色下观察海马CA1区DND的发生情况(方法同前)。结果显示,Sham组和CIP组大鼠海马CA1区无明显的DND,HG为0～Ⅰ级,ND值分别为208.25±5.97和202.86±4.28。脑缺血打击组大鼠海马CA1区出现明显的DND,HG(Ⅱ～Ⅲ级)明显升高(P<0.01),ND值(45.86±21.93)显著降低(P<0.01)。CIP+脑缺血打击组海马CA1区DND不明显,与脑缺血组相比,HG(0～Ⅰ级)明显降低(P<0.01),ND值(208.98±5.9)显著升高(P<0.01),表明CIP可以诱导海马CA1区神经元产生缺血性耐受,对抗缺血打击引起的DND。侧脑室注射双蒸水和AS-ODNs (9 nmol and 18 nmol)后海马CA1区组织形态与Sham组和CIP组基本一致,HG为0～Ⅰ级,ND值略有减少(分别为176.22±6.29、176.89±2.88和175.32±2.77(P<0.01)),表明侧脑室注射以及单纯AS-ODNs不会对海马CA1区神经元产生明显损伤。AS-ODNs+CIP+脑缺血打击组中,与CIP+脑缺血打击组相比,其HG显著升高(Ⅱ～Ⅲ级)(P<0.01),ND值显著下降(分别为133.56±3.42、70.94±7.38)(P<0.01),表明AS-ODNs抑制了GLT-1表达从而减弱了CIP对海马CA1区锥体神经元的保护作用。以上结果显示,单纯侧脑室注射AS-ODNs可引起海马CA1区GLT-1表达下调,但不引起明显的DND;而预先侧脑室注射AS-ODNs可减弱CIP对海马CA1区锥体神经元的保护作用。这些结果表明AS-ODNs通过抑制GLT-1表达从而减弱了CIP对海马CA1区锥体神经元的保护作用,进一步证实了GLT-1在CIP对脑缺血耐受诱导中的作用。3 GLT-1正义寡核苷酸上调GLT-1的表达增强脑对缺血打击的耐受应用GLT-1正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotides,S-ODNs)上调GLT-1的表达后,观察海马CA1区锥体神经元对脑缺血打击的耐受情况,进一步确定GLT-1在脑缺血耐受中的作用。3.1 GLT-1 S-ODNs上调GLT-1的表达将42只凝闭双侧椎动脉36 h的Wistar大鼠随机分为3组:①对照组(n=6):右侧脑室注射双蒸水5μl,注射后12 h取材;②S-ODNs 9 nmol组(n=18):右侧脑室注射S-ODNs溶液5μl(9 nmol),根据S-ODNs注射后取材的时间又分为三个亚组:12 h、24 h、36 h组;③S-ODNs 18 nmol组(n=18):右侧脑室注射S-ODNs溶液5μl(18 nmol),根据S-ODNs注射后取材的时间又分为三个亚组:12 h、24 h、36 h组。所有大鼠在预定时间断头取材,低温条件下分离海马CA1区,采用Western blotting方法测定GLT-1的蛋白表达(方法同前)。结果显示,双蒸水对照组的IOD的比值为0.64±0.19。注射S-ODNs 9 nmol组中,12 h组的IOD比值为0.78±0.02,24 h组为1.01±0.04, 36 h组为0.68±0.06。注射S-ODNs 18 nmol组中,12 h组的IOD比值为0.84±0.02,24 h组为1.23±0.03,36 h组为0.62±0.02。与双蒸水对照组相比,注射S-ODNs后IOD的比值显著增加(P<0.01),且呈现剂量依赖性。以上结果表明,侧脑室注射S-ODNs溶液可以剂量依赖性地上调GLT-1蛋白表达,这种上调作用在注射S-ODNs后24 h最为显著。3.2 GLT-1 S-ODNs增强海马CA1区锥体神经元对缺血打击的耐受性将凝闭双侧椎动脉的Wistar大鼠54只随机分为7组:①sham组(n=6):只暴露双侧颈总动脉,不阻断血流;②CIP组(n=6):夹闭双侧颈总动脉3 min;③脑缺血打击组(n=6):夹闭双侧颈总动脉8 min;④CIP+脑缺血打击组(n=6):夹闭双侧颈总动脉3 min作为CIP,再灌注2 d后再夹闭双侧颈总动脉8 min;⑤双蒸水组(n=6):于分离暴露双侧颈总动脉(但不夹闭)前12 h、后12 h及后36 h右侧脑室注射双蒸水,每次5μl,其他同sham组;⑥S-ODNs组(n=12):于分离暴露双侧颈总动脉(但不夹闭)前12 h、后12 h及后36 h右侧脑室注射S-ODNs溶液,每次5μl,其他同sham组。根据S-ODNs的剂量进一步分为9和18 nmol 2个亚组,每组6只动物;⑦S-ODNs+脑缺血打击组(n=12):于分离暴露双侧颈总动脉(但不夹闭)前12 h、后12 h及后36 h右侧脑室注射S-ODNs溶液,每次5μl,并于暴露双侧颈总动脉2 d后夹闭双侧颈总动脉8 min。根据S-ODNs的剂量进一步分为9和18 nmol 2个亚组,每组6只动物。以上各组动物均在sham手术或末次手术后7d断头取材,常规脑组织切片(5μm厚),硫堇染色下观察海马CA1区DND的发生情况(方法同前)。结果显示,Sham组和CIP组大鼠海马CA1区无明显的DND,HG为0～Ⅰ级,ND值分别为208.25±5.97和202.86±4.28。脑缺血打击组大鼠海马CA1区出现明显的DND,HG(Ⅱ～Ⅲ级)明显升高(P<0.01),ND值(45.86±21.93)显著降低(P<0.01)。CIP+脑缺血打击组海马CA1区DND不明显,与脑缺血组相比,HG(0～Ⅰ级)明显降低(P<0.01),ND值(208.98±5.9)显著升高(P<0.01),表明CIP可以诱导海马CA1区神经元产生缺血性耐受,对抗缺血打击引起的DND。侧脑室注射双蒸水和S-ODNs后海马CA1区组织形态与Sham组和CIP组基本一致,HG为0～Ⅰ级,ND值为176.22±6.29(双蒸水)、186.53±5.64(9 nmol S-ODNs)和204.4±12.99(18 nmol S-ODNs),与sham组或CIP组相比无显著性差异(P>0.05)。S-ODNs +脑缺血打击组的HG为Ⅰ级,与脑缺血打击组相比显著降低(P<0.01);ND值分别为148.53±9.1(9 nmol S-ODNs组)和166.67±8.31(18 nmol S-ODNs组),与脑缺血打击组相比显著增加(P<0.01);表明S-ODNs通过上调GLT-1蛋白表达从而减弱了脑缺血对海马CA1区锥体神经元的损伤。以上结果显示,侧脑室注射S-ODNs引起海马CA1区GLT-1表达明显上调,预先注射S-ODNs减弱了脑缺血打击对海马CA1区锥体神经元的损伤。这些结果证实S-ODNs通过增加GLT-1的蛋白表达从而减弱了脑缺血对海马CA1区锥体神经元的损伤,产生了与CIP相同的效果。4结语(1)谷氨酸转运体GLT-1抑制剂DHK通过抑制GLT-1的功能而减弱了CIP对海马CA1区锥体神经元的保护作用;(2)侧脑室注射谷氨酸转运体GLT-1 AS-ODNs可抑制GLT-1的表达,同时减弱了CIP对海马CA1区锥体神经元的保护作用;(3)侧脑室注射GLT-1 S-ODNs上调GLT-1表达的同时,增强了海马CA1区锥体神经元对脑缺血打击的耐受性,产生了与CIP相同的效果。(4)以上结果表明GLT-1参与了CIP诱导的BIT。