妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是一种在妊娠期首次发生或发现的不同程度糖代谢异常的内分泌代谢性疾病。近几年来GDM的发病率在全球均表现出逐年上升趋势。该疾病严重危害母亲及胎儿的健康,甚至危及围产儿的生命。氧化应激(oxidative stress,OS)是指机体在遭受各种有害刺激时,活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species,RNS)产生过多或发生代谢障碍,造成组织、细胞结构和功能上的损坏。研究表明,氧化应激可能通过激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-teminal Kinase,JNK)信号转导通路参与了糖尿病及其并发症的发生发展。国内外研究发现JNK在胰岛素信号转导通路、β细胞功能障碍、胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)以及多种应激反应引起的细胞凋亡中发挥着重要的作用。然而氧化应激和JNK的活化及其下游凋亡诱导因子Bax与GDM发病及流产、早产、胚胎畸形等并发症的相关性报道较少。本研究通过构建GDM孕鼠模型做为研究对象,检测孕鼠子宫和胎盘组织中氧化应激指标丙二醛含量(MDA)、超氧化物歧化酶活性(SOD)以及总抗氧化能力(T-AOC),并测定p-JNK以及凋亡诱导因子Bax蛋白在子宫和胎盘组织的表达情况,通过特异性抑制JNK活性,探讨JNK信号转导通路在GDM及其相关并发症中的作用,从而更好地为临床预防、诊断和治疗GDM提供理论依据和研究方向。本实验分为三部分:第一部分:妊娠期糖尿病大鼠模型的构建目的:探讨链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)建立GDM孕鼠模型中不同给药剂量对该模型稳定性的影响,为研究GDM对母体和胎儿影响提供较好的实验基础。方法:将获得的46只Sprague-Dawley孕鼠随机分为4组,分别一次性腹腔注射STZ 35 mg/kg,45 mg/kg,60 mg/kg和等量的柠檬酸盐缓冲液。于妊娠第3,9,14 ,19 d测空腹血糖,并观察成模孕鼠在妊娠周期中体质量、食量、饮水量及尿量的变化,比较孕鼠成模率、转阴率和死亡率。孕鼠在妊娠第19 d解剖,取其胰腺组织经常规HE染色后,光镜下观察病理分析。结果:STZ45 mg/kg组孕鼠在用药3d后出现明显的“三多一少”症状,其成模率最高(83.3%),转阴率最低。STZ45 mg/kg组与对照组空腹血糖值(mmol /L,21.8±3.0νs 5.9±1.2)比较,有统计学差异(P<0.05),体质量也明显减少,其高血糖状态持续时间较长且最稳定。结论:STZ45 mg/kg腹腔注射给药是建立GDM孕鼠模型的最佳剂量,具有较好的稳定性。第二部分:氧化应激和p-JNK蛋白在GDM孕鼠子宫和胎盘组织中的表达及其与IR相关性的研究目的:观察氧化应激和磷酸化c-jun氨基末端激酶(p-JNK)蛋白在妊娠期糖尿病孕鼠子宫和胎盘组织中的变化,探讨其在GDM发病中的作用。方法:应用比色法检测妊娠期糖尿病大鼠(GDM组,n=10只)和正常妊娠大鼠(正常妊娠组,n=10只)子宫和胎盘组织匀浆中丙二醛(MDA)水平、超氧化物岐化酶(SOD)含量以及总抗氧化能力(T-AOC)。采用免疫组化和western blotting法检测GDM组、JNK抑制剂SP600125(SP组)和正常妊娠组孕鼠子宫和胎盘组织中p-JNK蛋白的表达水平。同时检测各组孕鼠空腹血糖水平(FPG)、空腹胰岛素水平(FINS)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。结果:(1)GDM组孕鼠FPG、FINS及HOMA-IR水平均明显高于正常妊娠组(P<0.05)。GDM组孕鼠子宫和胎盘组织内MDA水平显著高于正常妊娠组(P<0.05),而SOD含量和T-AOC则明显低于正常妊娠组(P<0.05)。(2)p-JNK主要在子宫腺上皮、间质细胞和少量平滑肌细胞的胞浆和胞核中表达以及胎盘绒毛膜层及母胎界面蜕膜细胞的胞浆和(或)胞核中表达。GDM组子宫和胎盘组织中p-JNK的表达水平明显高于正常妊娠组,差异有统计学意义(P<0.05)。JNK抑制剂SP600125干预后GDM孕鼠子宫和胎盘组织中p-JNK表达显著减少(P<0.05)。(3)GDM组孕鼠子宫和胎盘组织中p-JNK蛋白表达水平与MDA含量呈正相关(P <0.05);与SOD含量以及T-AOC均呈负相关(P <0.05);而正常妊娠组则均无相关性。(4)GDM组HOMA-IR与子宫和胎盘组织中p-JNK蛋白表达水平呈正相关(P<0.05);而SP组及正常妊娠组则均无相关性(P<0.05)。结论:GDM孕鼠体内氧化应激程度与JNK蛋白的活化密切相关,而激活的JNK可能加剧了GDM胰岛素抵抗,p-JNK表达异常可能与GDM发病中有着重要的关系。第三部分:GDM孕鼠子宫和胎盘组织中p-JNK导致细胞凋亡机制的研究目的:观察凋亡诱导因子Bax在妊娠期糖尿病孕鼠子宫和胎盘组织中的变化。方法:采用免疫组化和western blotting法检测GDM组、JNK抑制剂SP600125(SP组)和正常妊娠组孕鼠子宫和胎盘组织中Bax的表达水平。结果: GDM组子宫和胎盘组织中Bax蛋白的表达水平明显高于正常妊娠组,差异有统计学意义(P<0.05)。JNK抑制剂SP600125干预后GDM孕鼠子宫和胎盘组织中Bax蛋白表达显著减少(P<0.05)。结论:GDM孕鼠体内活化的JNK可能导致子宫和胎盘细胞发生凋亡,导致GDM发生流产、早产、胚胎畸形等相关并发症。