酿酒酵母细胞膜中含有丰富的甾醇类活性物质,是活性维生素D及激素类药物的重要中间体。生物甾醇合成代谢中,甾醇C-4位脱甲基反应过程复杂,是甾醇活化的关键步骤,涉及了三步连续的氧化还原反应,在ERG25基因表达的C-4氧化酶(SMO),ERG26基因表达的C-3脱羧酶(3βHSD/D)及ERG27基因表达的C-3酮还原酶(3SR)的催化下,C-4位的甲基被特异性的氧化,脱羧,邻位的酮基还原为羟基后进行新一轮的脱甲基反应,最终实现C-4位双甲基的脱除。C-4脱甲基酶复合体中,除了Erg25p、Erg26p和Erg27p以外,另有一个跨膜支架蛋白Erg28p,其在麦角甾醇合成代谢中的相关研究相对较少。本课题拟采用酵母真核表达系统,研究酵母麦角甾醇合成通路中支架蛋白Erg28p在协助甾醇C-4脱甲基多酶体系中其他亚基的内质网膜正确定位及催化界面的有效形成中的生物学功能及关键作用位点,具体研究内容如下:本论文的第一部分内容通过loxP-Marker-loxP序列组件及Cre-loxP系统,建立ERG28基因敲除的酿酒酵母细胞模型(BY4741/ΔERG28),检测了野生菌BY4741和敲除菌BY4741/ΔERG28的干重,结果显示ERG28基因的敲除显著抑制了酿酒酵母的生长。构建了Erg28p蛋白表达载体(pYES2-ERG28),并在BY4741/ΔERG28菌株中转染pYES2-ERG28,建立回复表达ERG28基因的菌株(BY4741/ΔERG28-pYES2-ERG28),为研究Erg28p蛋白在甾醇合成代谢中的生物学功能建立细胞模型基础。本论文第二部分研究内容分析了Erg28p蛋白的生物学功能。利用气相质谱联用(GC-MS)法分析了BY4741/ΔERG28菌株和野生菌株细胞膜上麦角甾醇代谢组分及含量的差异,发现敲除菌BY4741/ΔERG28中麦角甾醇的前体产生累积,终产物麦角甾醇含量显著降低,证实麦角甾醇合成通路被阻断;在回复表达ERG28基因的菌株BY4741/ΔERG28-p YES2-ERG28中,麦角甾醇代谢通路的前体累积物质被重新去除,终产物麦角甾醇得到累积,从正反两个方向证实Erg28p蛋白参与酿酒酵母麦角甾醇合成代谢。此外,分别构建了GFP与Erg25p,Erg26p,Erg27p及Erg28p的融合表达载体,考察了Erg28p蛋白在C-4脱甲基多酶复合物中分子作用机制,证实Erg28p蛋白辅助C-4脱甲基多酶体系中其他亚基的蛋白折叠及内质网膜的定位,从而影响C-4甾醇脱甲基反应。本论文第三部分通过生物信息学方法分析并预测了Erg28p蛋白的关键作用位点,构建了一组Erg28p蛋白的截短突变表达载体,分别检测其麦角甾醇合成代谢途径中的中间代谢物,实验结果初步发现并证实Erg28p蛋白序列中63-72位氨基酸是甾醇C-4脱甲基酶体系中的关键作用残基,对酿酒酵母甾醇合成代谢通路有显著影响。