猪肌肉生长发育相关基因SMPX、STARS、VGLL2和VGLL4的克隆、定位及其与部分性状的关联分析

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提高瘦肉率和加快肌肉生长速度一直是猪育种研究的重点之一,但在当前要改良这些性状常规育种方法已受到了一定限制,结合分子标记辅助选择显然已成为猪育种改良的一种趋势。研究猪肌肉生长的分子机理不仅可以帮助人们了解动物肌肉生长发育的一般模式,也为研究动物生长模型提供很好的依据;同时这对改良猪的生长性状和进一步应用标记辅助选择奠定了基础。近年来,国内外虽已初步确定了一些肌肉生长相关的候选基因,但应用到实践生产中的不多,对猪肌肉生长的分子机理的研究也还不够深入。本研究利用生物信息学与分子生物学技术相结合的方法,在猪中克隆和定位了四个与肌肉生长发育密切相关的基因,并作了一些初步的功能研究与预测,取得了如下结果:1.结合猪EST数据库的信息和cDNA末端快速扩增(RACE)的方法,分离并鉴定了猪SMPX和STARS两基因的全长cDNA序列,并得到了VGLL2和VGLL4两个基因的部分序列,GenBank数据库收录号分别为DQ104414、DQ536197、DQ241740和DQ241739。同时利用生物信息学方法对SMPX和STARS两个基因的cDNA全长序列进行了分析,推导其氨基酸序列和可能的功能域。2.采用比较基因组方法,分离、鉴定得到猪SMPX基因的部分启动子序列,并对这段序列进行了转录因子结合位点分析,同时将这段序列提交GenBank数据库,获GenBank收录号为DQ104415。3.用SCHP和IMpRH克隆板,对SMPX、STARS、VGLL2和VGGL4四个基因分别进行了染色体区域定位和精细定位,结果表明SMPX基因定位于X染色体P24,与SW1903连锁(LOD值为7.04);STARS基因定位于4p13,与SW871连锁(LOD值为11.98);VGLL2基因定位在1p13,与SW1653连锁(LOD值为8.07);VGLL4则定位在13号染色体q23-(1/2 q41),与SW1864连锁(LOD值为5.75)。LOD值均在5.0以上。4.用半定量RT-PCR的方法,对SMPX和STARS两基因进行了组织表达谱和时期表达谱研究。结果表明猪SMPX和STARS基因都在心肌和骨骼肌中高表达,在其它组织低量或不表达;两基因在肌肉生长发育的不同时期也存在一定差异表达。5.对SMPX和STARS两基因进行了SNPs的检测,结果发现了SMPX基因3’UTR具有TaaI-RFLP(A-G),STARS基因CDS区有一Bsh1236I-RFLP(T-G)。利用PCR-RFLP方法检测了这两个SNPs在杜洛克、大白猪、民猪、清平猪、蓝塘猪、玉山猪、梅山猪和大花白猪中的基因型分布。同时进行了群体遗传学分析,卡方检验结果表明,这两个SNPs位点的基因型频率在不同的品种中存在较大的差异。6.在我室与通城县畜牧局合作组建的试验猪群中,采用方差分析的最小二乘分析法,利用广义线性模型对上述两个SNP位点与部分经济性状进行了初步的关联分析。结果发现,SMPX基因TaaI多态性与肌内脂肪含量有极显著的关联(P<0.01);STARS基因Bsh1236I多态性与平均背膘厚有极显著的关联(P<0.01)。7.构建猪SMPX基因重组原核表达载体pET28a-SMPX,利用SDS-PAGE检测出该重组原核表达载体成功表达出了猪SMPX蛋白,为进一步研究SMPX的生物学特性和功能奠定了基础。
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