【摘 要】
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我国当前作为全世界生产柑橘的第一大国,在柑橘的采后贮藏、运输过程中,常发生各种病原微生物引发的多种病害,导致柑橘的腐烂,并对柑橘产业造成巨大的损失,其中柑橘绿霉病是
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我国当前作为全世界生产柑橘的第一大国,在柑橘的采后贮藏、运输过程中,常发生各种病原微生物引发的多种病害,导致柑橘的腐烂,并对柑橘产业造成巨大的损失,其中柑橘绿霉病是最为主要的真菌病害之一。指状青霉(Penicillium digitatum)是柑橘采后主要病害绿霉病的病原菌。其在柑橘采收后从果实伤口处入侵,并以较快速度侵染果实,引起柑橘腐烂。为了有效控制该病害,可通过农杆菌介导的遗传转化技术,探明指状青霉菌的致病机制,从而更好地防治柑橘绿霉病。本研究探索了农杆菌介导的指状青霉转化的各项条件,并对部分转化子进行了分子分析。结果如下：初步建立了农杆菌介导的指状青霉转化体系。结果表明：农杆菌介导的转化体系中最适宜指状青霉浓度为1×106个/ml,农杆菌浓度为OD600=0.15-0.25,共培养时长为48h,进行筛选的是40μg/ml的潮霉素B。具体过程是：将浓度是1×106个/ml的指状青霉菌孢子悬浮液,及预培养过程中添加了200μmol/l乙酰丁香酮后得到的OD600=0.15-0.25的含质粒pTFCM的根癌农杆菌AGL-1菌液,等体积混合后在贴有玻璃纸的CO-IM培养基(含200μmol/lAS)上于24℃避光诱导培养48h,将玻璃纸转移至灭菌的培养皿上,在玻璃纸上覆盖含有40μg/ml潮霉素B和200μg/ml头孢噻肟钠的筛选培养基。24℃培养4-5d后,将PDA培养基上长出的待定指状青霉转化子菌落挑至含40μg/ml潮霉素B的PDA培养基上进行再次筛选。能生长者再将其转接于PDA培养基上,传代5次,一次5天后将其接种于含有40μg/ml潮霉素B的PDA培养基上,25℃培养4天后,能长出菌落的即证明获得的转化子能稳定遗传。对转化子进行了分子分析。提取指状青霉野生菌及其转化子的基因组DNA,用引物hphl和hph2对6株转化子基因组DNA中的T-DNA插入片段潮霉素B基因hph进行PCR扩增。结果证明转化子中均含有插入的潮霉素片段。本研究利用Tail-PCR方法初步扩增了转化子插入的T-DNA目标片段一侧基因组的片段。
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