背景与目的骨肉瘤是好发于儿童和青少年的一种恶性骨肿瘤,约占恶性骨肿瘤的35%,具有很高的侵袭转移能力。虽然骨肉瘤诊断与治疗的手段日新月异,但近几十年来全球的骨肉瘤患者总体5年生存率仍然徘徊不前,肺部转移是骨肉瘤患者目前最主要的死亡原因,其根本原因骨肉瘤细胞在早期就通过血管进入肺部并形成细胞克隆,所以骨肉瘤患者在临床确诊时,就有80%的人往往已经发生肺部微转移,因此,骨肉瘤转移相关分子机制的探讨是骨肉瘤研究领域的重点和热点之一,对诊治和预防骨肉瘤侵袭转移和提高生存率具有重大意义。目前研究已证实基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是细胞基底膜及外基质降解过程中不可缺少的一类酶,其家族中的MMP-2及MMP-9与肿瘤侵袭转移的关系又最为密切。在骨肉瘤的发生发展过程中,MMP-2及MMP-9常常为过度表达、并通过对细胞外基质和基底膜中不同成分的降解、破坏,导致骨肉瘤细胞逐步侵袭,最终向肺等部位侵袭转移。此外,MMP-2及MMP-9还可通过诱导毛细血管新生,促进骨肉瘤细胞生长与转移灶的形成。大量研究证明,MMPs促进肿瘤细胞迁徙侵袭与其上游基因NF-KB的活化转位密切相关。现已证实Akt对于IKKs介导的I-κB降解和NF-κB的激活是必需的,是NF-κB依赖的基因转录的重要调节因素。HER2是一个与骨肉瘤侵袭转移密切相关的重要信号蛋白。HER2是一种跨膜受体型酪氨酸蛋白激酶,在细胞信号转导中发挥重要作用,其介导的胞内信号途径主要是PI3K/Akt信号途径。现已证实HER2能够在没有细胞外配体的情况下发生自身磷酸化激活,并通过激活PI3K/Akt通路及NF-κB转录途径,促进包括骨肉瘤在内的多种肿瘤的侵袭转移。近来研究表明脂肪酸代谢途径在恶性肿瘤细胞转移中起着非常重要的作用。研究证实脂肪酸代谢途径中起关键作用的癌基因FASN在多种恶性肿瘤细胞中呈现过表达,并且不受正常细胞中调节信号的调控,自行合成大量脂类物质,用于细胞膜类结构的构造,满足肿瘤细胞不断增殖的需要,抑制FASN能有效地诱导肿瘤细胞凋亡、抑制细胞增殖。随着对FASN研究的深入,FASN在肿瘤侵袭转移中的作用也开始受到越来越多的关注。FASN在头颈部鳞状细胞癌高表达与头颈部鳞状细胞癌肺转移正相关,并且FASN高表达是头颈部鳞状细胞癌肺转移的一个重要特征。最近有研究表明抑制FASN能有效的抑制肿瘤细胞侵袭转移,但是其具体分子机制尚未见报道。另外,FASN在骨肉瘤组织细胞中的表达情况、是否与骨肉瘤转移有关及其分子机制尚未见报道。研究表明FASN是HER2的一个重要调控蛋白。最近在人乳腺上皮细胞中发现FASN过度过表达可导致细胞内内源性脂肪酸(FA)大量合成,而内源性FA大量生物合成作为内在的刺激信号引起HER2二聚化并发生自身磷酸化而活化,随后进一步激活其下游的PI3K/Akt信号通路和NF-κB转录途径。为此,我们推测FASN可以通过激活HER2/PI3K/AKT/NF-κB信号通路促进骨肉瘤细胞侵袭转移。为探讨FASN在骨肉瘤细胞侵袭转移中的作用及其分子机制,我们以pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR为载体构建靶向FASN基因的miRNA的表达载体,转染骨肉瘤细胞抑制FASN的表达水平,划痕愈合实验和Transwell侵袭实验检测细胞的迁徙、侵袭能力的变化；RT-PCR和western blot实验检测HER2/PI3K/AKT/NF-κB信号通路相关蛋白表达变化情况。研究目的：1.免疫组织化学方法检测骨肉瘤组织石蜡标本中FASN蛋白表达水平,分析骨肉瘤组织标本中FASN蛋白表达水平与临床病理参数的关系,为研究FASN参与骨肉瘤转移及机制提供组织学证据。2.构建靶向FASN基因的miRNA表达载体,转染骨肉瘤细胞U2-OS,经体外实验检测细胞迁徙、侵袭能力的改变,旨在证实抑制FASN能抑制骨肉瘤细胞迁徙侵袭,反向论证FASN高表达促进骨肉瘤细胞迁徙侵袭,为进一步研究FASN调控HER2/PI3K/AKT/NF-κB信号通路促进骨肉瘤侵袭转移提供依据。3.靶向FASN基因的miRNA重组质粒转染骨肉瘤细胞U2-OS,检测HER2/PI3K/AKT7NF-κB信号通路相关因子表达变化情况,旨在证实抑制FASN能抑制HER2/PI3K/AKT/NF-κB信号通路,反向论证FASN调控HER2/PI3K/AKT/NF-κB信号通路促进骨肉瘤侵袭转移。材料和方法一、FASN蛋白在骨肉瘤组织中的表达及意义选取手术切除的骨肉瘤组织石蜡标本136例和21例骨软骨瘤组织石蜡标本。包括骨肉瘤肺转移44例；其中男性84例,女性52例,年龄7-74岁,平均19.4岁。全部标本均经临床、影像学及病理组织学确诊为骨肉瘤。手术前所有病例均未经放射治疗及化学药物等抗肿瘤治疗,术前均行肿瘤局部X线片和CT、肺部CT、胸片、全身骨扫描等检查。病理类型：骨母细胞型骨肉瘤78例,纤维母细胞型骨肉瘤34例,软骨母细胞型骨肉瘤24例。进行免疫组织化学法检测FASN蛋白的表达水平,分析FASN蛋白表达水平与各临床病理参数的相关性。二、RNAi沉默FASN基因对骨肉瘤细胞U2-OS迁徙侵袭的影响1.构建靶向FASN基因的miRNA重组质粒从GenBank中查询到人FASN蛋白的编码基因FASN的cDNA序列(NM004104.4)设计并合成4对miRNA和1对阴性对照寡聚单链DNA。将4对寡聚单链DNA退火成双链。然后用载体构建试剂盒BLOCK-iTTM Pol Ⅱ miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP (invitrogen, Catalog no. K4936-00)进行重组克隆,将4对双链的miRNA oligo分别插入到miRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中,构建4个靶向FASN基因的miRNA重组质粒(分别命名为：X197-1-1、X197-2-1、X197-3-2、X197-4-1),并转化至感受态细胞DH5α。每个转化平板分别挑取4个克隆,摇菌抽提质粒后进行测序,以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的寡聚单链DNA序列一致。转染骨肉瘤细胞U2-OS,筛选出转染率最高的质粒为进一步实验的重组质粒,并优化转染条件,RT-PCR和Western blot检测重组质粒对FASN的6mRNA及蛋白表达水平影响。2. RNAi沉默FASN对骨肉瘤细胞U2-OS体外迁徙、侵袭力的影响采用在上一实验中筛选出的转染率最高的靶向FASN基因的miRNA重组质粒,按照所优化的转染条件(质粒Lipofectamine2000为1：3.0)转染骨肉瘤细胞U2-OS,体外划痕愈合和Transwell侵袭实验检测细胞迁徙、侵袭能力,空载体转染细胞为阴性对照组,未转染细胞为空白对照组。分析各组细胞迁徙、侵袭能力的差异。三、RNAi沉默FASN对HER2/PI3K/AKT/NF-κB信号通路影响采用在上一实验中筛选出的靶向FASN基因的miRNA重组质粒,按照所优化的转染条件(质粒Lipofectamine2000为1：3.0)转染骨肉瘤细胞U2-OS,RT-PCR和western blot检测HER2/PI3K/AKT/NF-κB信号通路相关蛋白表达变化,空载体转染细胞为阴性对照组,未转染细胞为空白对照组。统计学处理采用SPSS13.0统计软件对数据进行分析。等级资料采用非参数秩和检验分析。计量资料表示为平均数±标准差,各组间差异性采用单因素方差分析。P<0.05为有统计学意义。结果一、FASN蛋白在骨肉瘤组织中的表达及临床意义1. FASN蛋白在骨肉瘤组织和骨软骨瘤组织中的表达差异FASN在骨肉瘤组织中的表达水平显著高于在骨软骨瘤组织中的表达水平,(P=0.000),这提示FASN蛋白在骨肉瘤组织中高表达,FASN可能可以成为骨肉瘤治疗的分子靶点。2. FASN蛋白表达水平与肺部转移的关系发生肺部转移和无肺部转移的骨肉瘤组织中FASN蛋白表达水平差异有显著意义(P=0.002),发生肺部转移的骨肉瘤组织中FASN蛋白表达水平显著高于未发生肺部转移的骨肉瘤组织中FASN蛋白表达水平。这提示FASN可能骨肉瘤肺部转移有关。3. FASN蛋白在骨肉瘤组织中的表达水平与患者年龄、性别和病理类型以及Ennecking分期无统计学相关性(P>0.05),但是在肿瘤直径大于8厘米的骨肉瘤组织的表达水平显著高于小于8厘米的肿瘤组织中的表达水平(P=0.013),这提示FASN很可能参与骨肉瘤细胞增殖。二、RNAi沉默FASN基因抑制骨肉瘤细胞U2-OS迁徙侵袭1.靶向FASN基因的miRNA重组质粒构建和鉴定1.1.测序显示各重组质粒中表达目的miRNA的双链寡核苷酸片段接入正确,无点突变,这提示靶向FASN基因的miRNA重组质粒构建成功。1.24个重组质粒转染24小时后均能有效的转染细胞,X197-1-1转染率最高,这提示所构建的4个靶向FASN基因的niRNA重组质粒均能有效的转染骨肉瘤细胞,并且以X197-1-1重组质粒转染率最好,选择重组质粒X197-1-1为进一步实验质粒。1.3分别采用质粒：Lipofectamine2000不同比例,重组质粒X197-1-1转染U2-OS细胞24小时后荧光显微镜观察显示有不同程度细胞显示绿色荧光,结果显示质粒Lipofectamine2000为1：3时转染率最高,所以优化转染条件选择以质粒：Lipofectamine2000为1：3。1.4与空载体转染组和对照组(未转染组)相比,X197-1-1重组质粒转染组细胞中FASN mRNA和蛋白的表达水平显著下调,这提示靶向FASN基因miRNA重组质粒X197-1-1能有效的抑制FASN的表达。2. RNAi沉默FASN抑制骨肉瘤细胞U2-OS体外迁徙、侵袭2.1.靶向FASN的miRNA重组质粒X197-1-1转染组细胞迁徙率是10%±4%,显著低于空载体组转染组(84%±5.4%)和对照组(未转染组)(87%±8.5%),这提示抑制FASN基因能显著的抑制骨肉瘤细胞U2-OS的迁徙。2.2.靶向FASN的miRNA重组质粒X197-1-1转染组穿膜细胞数是22.2±5.6个(400倍),显著低于空载体转染组(91±11.3)个和未转染组(93.7±10.3)个,这提示抑制FASN能显著的降低骨肉瘤细胞U2-OS的侵袭能力。三、RNAi沉默FASN抑制HER2/PI3K/AKT/NF-κB信号通路的影响1.抑制FASN降低骨肉瘤细胞中HER2磷酸化水平与空载体转染组和对照组(未转染细胞组)相比,靶向FASN基因的miRNA重组质粒X197-1-1转染细胞24小时后细胞中pHER2蛋白表达水平显著降低,这提示沉默FASN基因能显著的降低HER2的磷酸化水平。2.抑制FASN下调骨肉瘤细胞中AKT磷酸化水平和NF-κB转入与空载体转染组和对照组(未转染组)相比,靶向FASN基因的miRNA重组质粒X197-1-1转染细胞24小时后细胞中pAKT、NF-κBp65、MMP2、MMP9的蛋白表达水平显著下降,这提示抑制FASN基因能显著降低AKT磷酸化而抑制NF-κB核转入和MMP2、MMP9的表达。结论1. FASN蛋白在骨肉瘤组织中过度表达,并且与骨肉瘤肺部转移密切相关。2.本研究成功的构建了靶向FASN基因的miRNA重组质粒。3.沉默FASN能有效的抑制骨肉瘤细胞U2-OS的迁徙和侵袭。4.沉默FASN能抑制HER2和AKT的磷酸化水平,抑制NF-κB核转入从而下调MMP9的表达,最终抑制骨肉瘤细胞U2-OS的迁徙和侵袭。