乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)一直以来就威胁着全人类的健康,核苷(酸)类似物作为抗HBV感染的主要药物,在抑制病毒方面取得了不错的成果。但随着用药时间延长,HBV都会在不同程度上表现出耐药,严重制约后续药物的选择及其疗效,那么,早期监测耐药就显得至关重要。目前,多数HBV耐药突变检测技术限于实验研究,只有直接测序法,荧光定量PCR和线性探针分析法三种检测技术用于临床耐药分析。相对其他两种技术而言,基于反向杂交原理的线性探针分析法简便,快速,可以实现多位点检测,具有广阔的应用前景。拉米夫定,阿德福韦和恩替卡韦是最早应用于临床乙型肝炎治疗的药物,本研究就是利用反向杂交原理,建立一种同时检测HBV对这三种药物耐药的方法。为了优化反应条件,本研究还构建了HBV耐药标准株。随后,对已建立的反向杂交体系进行方法学评价和临床评估。目的:构建HBV耐药标准株,利用野生和耐药标准株建立一种特异、灵敏地检测HBV对三种核苷(酸)类似物耐药的方法,并对确立的检测体系进行评估以便了解其可行性。方法:1.以扩增得到的267bp的突变片段(rt169T, rt173L, rt180M, rt181T, rt184G, rt202I, rt204V, rt215S, rt236T, rt250V)为诱变引物,HBV野生标准株为模板,PCR获得HBV全序列耐药标准株。2.利用HBV野生和耐药标准株对反向杂交体系进行一系列优化,并筛选三种药物相关的十个耐药位点的理想探针(I169T, V173L/G, L180M, A181T/V, T184G, S202I/G, M204V/I,Q215S,N236T,M250V/I/L)。3.对建立的反向杂交体系进行方法学评价和临床评估。应用本方法分别检测HBV野生和耐药标准株,分析其检测特异性;将PCR产物以一定比例稀释,确定其对PCR产物量的检测下限;以一定比例混合野生和耐药标准株,分析本方法对野生或耐药突变的检测灵敏度。为进一步了解其临床可行性,应用本方法对10份未接受核苷(酸)类似物治疗和30曾接受核苷(酸)类似物治疗的乙型肝炎患者血清标本进行检测,其结果与直接测序法分析结果进行比较,分析其检测准确性以及对病毒载量的检测下限。结果:1.成功构建了HBV耐药标准株(rt169T, rt173L, rt180M, rt181T, rt184G, rt202I, rt204V, rt215S, rt236T, rt250V),经直接测序证实,其碱基序列与目的序列一致。2.初步确立反向杂交体系,并筛选到较为理想的检测探针。应用此方法可以区分单碱基差异,从而检出三种药物十个位点相关的耐药突变。3.方法学评价和临床评估的实验结果证实本方法可以灵敏,特异地检出HBV耐药突变。当PCR产物的量达到10ng/μl时,本方法有效检测杂交信号;当HBV野生或耐药突变株占到病毒群体的5%时,可以被检测。临床标本的检测结果与直接测序法分析结果一致,且病毒载量在10~4拷贝/ml以上时,可以有效检测。结论:本研究通过诱变引物替换野生标准株上对应序列,快速,准确地构建HBV耐药标准株,这种方法为构建其他耐药突变体提供了新思路。在第二部分中,本研究利用野生和耐药标准株优化反应体系,并建立了一种同时检测HBV对三种核苷类似物耐药的方法。为有效区分HBV野生和耐药株,放大两者之间的单碱基差异,本研究作了许多有益的尝试,其中,选用含有氯化四乙铵的杂交液,探针两端加同聚物修饰,引物标记三个地高辛都取得了不错的效果。最后,通过方法学评价和临床可行性的分析,证明建立的检测体系是特异,灵敏的,可用于HBV耐药突变的检测。