论文部分内容阅读
脯氨酸氨肽酶(PAP;E.C.3.4.11.5)作为一种外切蛋白酶可以特异性地切割蛋白质N端的脯氨酸残基,具有严格的底物特异性。PAP多应用于蛋白类食品水解产物的脱苦和生物活性多肽的制备,也可应用于生物医疗检测和诊断。本论文以来源于米曲霉(Aspergillus oryzae JN-412)中的PAP(AoPAP)为研究对象,对其分别进行随机突变、半理性设计、突变热点研究、酶学特性分析、枯草表达验证和蛋白结晶条件摸索等工作。主要研究内容如下:为构建一个合适突变频率的随机突变文库,通过添加不同浓度的Mn2+进行易错PCR,结果发现Mn2+浓度为0.05 mmol·L-1时,可以在AoPAP基因序列上产生1-3个氨基酸突变。利用高通量筛选方法,从3000个转化子中筛选得到最优突变体3D9(V147A/K415R),其比酶活从100 U·mg-1提高至127 U·mg-1,比野生型(WT)提高27%。酶学特性分析,其最适反应温度从50℃提升至55℃,且在50℃下的半衰期比WT 延长 4.5 h。通过对AoPAP模拟结构的分析,找出其底物结合口袋附近的非保守性氨基酸Cys-185、Tyr-393、Val-399、Leu-427,分别对其进行定点饱和突变。筛选结果发现185位点是AoPAP催化底物水解的关键位点,最优突变体C185V、C185A、C185I和Y393W的比酶活分别为156、128、116、120 U·mg-1,其中C185V的比酶活提升幅度最大,比WT提高56%,动力学分析kcat/Km值从154.9 s-1·mM-1提高至293.5 s-1·mM-1。酶学特性分析,C185V的最适温度也提高至55℃,半衰期延长1.0 h,且C185V的最适反应pH从7.5下降至6.5,在pH为6.5的条件下其半衰期比WT延长2.0 h。基于以上AoPAP分子改造和酶学特性,将最优突变C185V引入枯草芽孢杆菌进行表达验证和酶学特性验证。成功构建出突变体B.subtilis WB600-pMA5-AoPAPC185V,摇瓶水平突变株最高总酶活为253 U·mL-1,是原始菌B.subtilis WB600-pMA5-AoPAPWT的2.25倍,5 L发酵罐最高总酶活为338 U·mL-1,是原始菌的1.5倍。酶学性质分析,突变株的最适温度为50℃,最适pH为6,在50℃下的半衰期为8 h,比原始菌延长1 h;在pH为6.5下半衰期为8 h,比原始菌延长6 h。为深入探索AoPAP的底物催化水解机制,本文尝试对其结晶条件进行摸索。将发酵产生的粗酶液通过Ni2+亲和层析、Superdex G-75凝胶柱纯化和30 kDa超滤管浓缩,最终蛋白浓度达到20 mg·mL-1,纯度达到电泳纯,符合结晶要求。经过对蛋白晶体的初筛和优化,最终在 0.2 mol·L-1 氯化镁,0.1 mol·L-1 HEPES,pH 7.5,35%PEG 400 条件下得到高质量的晶体。