柯萨奇A组16型病毒(Coxsackievirus A16,CVA16)是小RNA病毒科肠道病毒属病毒,是手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)的主要致病原之一,其病毒颗粒为无包膜的对称球状颗粒。CVA16主要易感人群为0-5岁婴幼儿,患者出现的主要临床症状包括包括手足口部位疱疹、发热、急性咽峡炎等,重症患者出现以心、肺及神经系统为主的全身性炎症反应,其中神经源性肺水肿和肺出血是重症病例死亡的主要原因[1]。与肠道病毒71型(Enterovirus A 71,EVA71)相比,CVA16感染还具有反复性的特点,目前还未有能够防治其感染的疫苗出现。炎性小体(Inflammasome)是一组胞质蛋白复合物,它能够活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(Cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1),从而促进白介素-1β(Interleukin 1 beta,IL-11β)和白介素-18(Interleukin 18,IL-18)的成熟和分泌[2,3]。NLRP3炎症小体是目前了解最深入的一种炎性小体,由NOD(Nucleotide binding oligomerization domain,NOD)样受体家族 3(NOD-like receptors,NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)和Caspase-1 前体(pro-Caspase-1)组成。在激活的情况下,NLRP3和ASC中的Pyrin结构域(PYD)之间的相互作用,ASC的半胱天冬酶募集结构域(Caspase recruitment domain,CARD)与pro-Caspase-1 上的CARD结构域结合,三者共同形成NLRP3炎性体复合物[2,4,5]。该复合物的形成触发pro-Caspase-1自我切割,产生活性caspase-1 p10/p20四聚体并诱导IL-1β和IL-18从其未成熟的前体形式(pro-IL1β、pro-IL18)转化为分泌型活性形式,产生炎症效应。炎症小体能够识别病毒感染,启动固有免疫和炎症反应,是重要的天然免疫防御机制之一[6]。能够激活NLRP3炎性小体的病毒种类很多,其中包括许多RNA病毒如流感病毒[7]、丙肝病毒[8]、EVA71[9]等。本研究主要探究CVA16病毒感染是否能够激活NLRP3炎性小体、可能存在哪些机制以及激活后NLRP3炎性小体在感染后组织炎症中的作用。主要研究内容分为两方面:一、在体外实验中,我们检测到了在Vero、KMB17以及SHSY5Y三种细胞系中,CVA16感染可激活NLRP3炎性小体。使用共聚焦显微镜在三种细胞中均可以直观的观察到NLRP3炎性小体的组装。组装后的NLRP3炎性体将Caspase-1从酶原形式活化为酶形式,从而将pro-IL1β切割为活性形式的IL-1β,发挥致炎作用。细胞水平的研究还表明,三种细胞中激活的机制可能是不同的,原因可能是细胞间差异导致的应激机制的差异。二、在体内实验中,本研究首先使用CVA16病毒感染1日龄BALB/c乳鼠,在乳鼠的肺组织中观察到NLRP3激活的表现。由于恒河猴更接近人类的动物模型,我们进一步使用CVA16-EGFP病毒感染一岁龄恒河猴。感染后恒河猴肺部呈现较重的炎性症状,但无明显的中枢神经系统症状。在感染的恒河猴外周血淋巴细胞中,NLRP3炎性小体被动员,活性的炎性因子IL-1β表达。在炎性损伤较为严重的肺部,可观察到NLRP3相关蛋白表达、IL-1β活化等现象。此外,我们观察到NLRP3与ASC蛋白在肺组织中发生共定位,充分证明NLRP3炎性小体发生组装且在肺组织中发挥着致炎作用。而在恒河猴脑部即未观察到显著的病理症状,也未能观察到NLRP3炎性小体的激活。综合我们的研究结果表明,CVA16体外感染细胞能够激活NLRP3炎性小体,但具体激活机制尚不清晰。CVA16感染的动物模型中,NLRP3炎性小体同样被激活,其激活与感染所引起的炎性症状息息相关。