自20世纪60年代人工培育淡水珍珠实验成功后,我国的珍珠养殖业得到了迅猛发展。然而,由于种质退化、养殖环境恶化、珍珠培育时间短等原因,使我国淡水珍珠产业出现了“高产低值”现象。软体动物通过摄食从外界水环境中摄取无机矿物离子,并在外套膜和珍珠囊上皮细胞分泌的有机基质的调控下有序沉积形成了贝壳和珍珠。研究贝壳珍珠层基质蛋白的功能及其影响因素,对理解珍珠形成机理及提高珍珠质量具有重要意义。本研究以我国重要的淡水育珠蚌三角帆蚌(Hypriosis cumingii)为研究对象,从分子和蛋白水平研究了贝壳基质蛋白基因在珍珠质形成过程中的功能,明确基质蛋白基因表达与珍珠重量性状之间的关系,研究了温度变化和珍珠囊细胞转分化对珍珠质沉积及相关基质蛋白基因表达的影响。主要结果如下:1.三角帆蚌贝壳珍珠层基质蛋白基因的克隆和功能分析从三角帆蚌外套膜组织中克隆得到基质蛋白基因teosin,cDNA全长522bp,编码70个氨基酸,其中N端的前19个氨基酸为信号肽序列,成熟蛋白的N端为疏水区,C端为亲水区。氨基酸组成中含有较高比例的Gly,Cys和Pro,且Cys大多位于亲水区,二级结构主要为β折叠。半定量和实时荧光定量结果显示teosin主要在外套膜和血液中表达,外套膜组织原位杂交结果显示teosin基因主要在缘膜部上皮细胞中表达。RNA干扰实验中,teosin在外套膜中表达量下降后,贝壳珍珠层的文石晶体杂乱堆积且成核位点晶体的生长受到明显的抑制。在体外结晶实验中,teosin能够诱导产生大体积的多晶。这些研究结果表明teosin是珍珠层基质蛋白,参与调控晶体形貌并能诱导产生多晶。从三角帆蚌外套膜组织中克隆得到丝氨酸蛋白酶抑制剂基因HcKuPI,序列全长543bp,包含一个333bp的开放阅读框,编码110个氨基酸,其中前24个为信号肽。成熟氨基酸序列中富含赖氨酸(20.9%),甘氨酸(12.8%)和丝氨酸(10.5%),理论分子量为9.5kDa,等电点为9.96。HcKuPI含有一个Kunitz结构域,编码的氨基酸序列具有明显的模块化结构,N端为信号肽序列,中间为赖氨酸富集区,C端为Kunitz结构域。组织荧光定量和原位杂交结果显示,HcKuPI在外套膜缘膜的外上皮细胞中特异性表达。在RNA干扰实验中,HcKuPI表达抑制后,贝壳珍珠层的文石小片表面变得粗糙且杂乱堆积,说明HcKuPI主要参与珍珠层生物矿化。原核表达得到可溶性的重组蛋白GST-HcKuPI,体外结晶实验结果显示,GST-HcKuPI能够加快碳酸钙晶体的沉积速率,能够诱导晶体过度生长并进一步调控晶体形貌。以上研究表明HcKuPI在珍珠层形成过程中能够加快碳酸钙晶体的沉积速率并且调控晶体的形貌。2.基质蛋白基因在珍珠囊中的表达及与珍珠重量的相关性分析观察了插片后第一个月珍珠形成过程中碳酸钙的沉积过程,并分析了基质蛋白基因在珍珠囊中的表达情况。扫描电镜结果显示,在插片后的第15天,黄褐色珍珠表面为无序沉积的碳酸钙晶体;第18和21天,有机膜逐渐覆盖珍珠颗粒并且碳酸钙晶体开始在有机膜上沉积,生长方式由无序变为有序;第24-30天,碳酸钙晶体有序的沉积在珍珠表面,文石小片形状趋于规则,并逐渐与周边的晶体连成一片,最终形成致密的珍珠层。荧光定量结果显示,在碳酸钙无序沉积阶段,棱柱层基质蛋白hic31表达量显著升高;在碳酸钙晶体由无序沉积转变为有序沉积阶段,类蚕丝蛋白silkmapin和teosin表达量显著升高;在碳酸钙晶体有序沉积形成致密珍珠层的过程中,贝壳珍珠层基质蛋白基因持续高表达,说明珍珠形成过程中,碳酸钙的无序沉积和有序沉积阶段都是受基质蛋白严格调控的。此外,对插片后6个月内的基质蛋白基因的表达情况与珍珠重量性状进行了相关性分析,结果表明棱柱层基质蛋白基因hic31和珍珠层基质蛋白基因hic22与珍珠重量呈显著负相关;类蚕丝蛋白基因silkmapin和teosin与珍珠重量无显著相关性;珍珠层基质蛋白基因(hic24、hic52、hic74、HcCA3、Hcperlucin、HcTyr、Hc-upsalin和HcKuPI)与珍珠重量呈显著正相关。以上研究表明贝壳基质蛋白参与调控珍珠形成过程中碳酸钙的沉积并且影响珍珠质量性状。3.温度变化对珍珠质沉积速度及基质蛋白基因表达的影响插片后的育珠蚌分别放在不同温度梯度的水箱中培育1个月后,在16℃和20℃水温中未能收集到珍珠颗粒,24℃水温中出现少量褐色珍珠颗粒,表面覆盖为一层有机膜,28和32℃水温中出现有珍珠光泽的珍珠颗粒,表面为有序堆积的文石小片。荧光定量结果显示在16、20和24℃水温中,hic31和silkmapin在第28天表达量显著升高,而珍珠层基质蛋白维持低水平表达;在28℃水温中,hic31和silkmapin在第28天表达量达到最高,并且珍珠层基质蛋白(hic22、hic24、HcTyr和Hc-upsalin)表达量也显著上升,在32℃水温中,hic31和silkmapin在第14天表达量达到最高,珍珠层基质蛋白基因(hic22、hic24、HcTyr和Hc-upsalin)在第28天表达量显著升高,以上研究表明,升高水温能够加快珍珠囊和珍珠的形成。在自然水域中,水温的季节变化对珍珠质的沉积速度和基质蛋白的表达也有显著影响。在一年四季中,冬季珍珠质的沉积速率最慢,夏季珍珠质的沉积速率最快,其中6月份和8月份珍珠质的沉积速度最快,对应的平均水温是28.3℃和30.3℃;基质蛋白荧光定量结果显示hic31、silkmapin、teosin和hic22在冬季的表达量最高,其他珍珠层基质蛋白基因则往往在水温较高的季节表达量显著升高。以上研究结果表明水温能够影响珍珠质的沉积速度,28.3℃-30.3℃范围内,珍珠质的沉积速度最快,温度同样影响基质蛋白基因的表达。本实验为进一步研究基质蛋白基因与珍珠生长的关系提供理论基础。4.珍珠囊细胞转分化现象对珍珠质沉积及基质蛋白表达的影响在小片移植过程中,将外套膜上皮细胞分成边缘膜和缘膜部两部分,制成小片后分别植入育珠蚌的左右两侧。在插片后的第3个月和第6个月分别取珍珠颗粒和珍珠囊组织进行扫描电镜观察和荧光定量检测。扫描电镜结果显示,插片后第3个月,缘膜部小片培育得到富有光泽的珍珠颗粒,表面堆积着平行生长的文石小片。边缘膜小片培育得到无光泽的珍珠颗粒,表面堆积着垂直生长的针状晶体。插片后第6个月,缘膜部小片培育的珍珠颗粒表面为致密的文石晶体,边缘膜小片培育得到的珍珠颗粒表面出现平行生长的文石小片并开始逐步覆盖棱柱层。截面微观结构显示,在众多棱柱中间出现了横向生长的文石小片。边缘膜珍珠囊荧光定量结果显示,珍珠层基质蛋白在第6个月的表达量显著高于第3个月。以上研究结果表明,插片后6个月边缘膜上皮细胞可能发生了转分化,开始分泌珍珠层有机基质调控珍珠质沉积。