波纹巴非蛤抗氧化寡肽的酶法制备及其外源氨基酸修饰的研究

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波纹巴非蛤(Paphia undulata)是一种高蛋白、低脂肪的海洋贝类资源。但目前面临的问题是波纹巴非蛤产量日益增大与其尚未得到充分利用的矛盾。以带壳鲜销为主的经营方式使得波纹巴非蛤的开发缓慢,经济价值有限。随着人们对生活水平要求的提高,生物活性肽受到研究者的热捧。其中,以低值蛋白资源为原料进行生物活性肽的制备,很好地解决了成本、安全和高价值的矛盾关系。本研究以波纹巴非蛤为原料,通过优化抗氧化肽的酶解工艺参数,制备抗氧化活性寡肽,对整个酶解过程进行了酶解动力学和寡肽释放动力学的研究,目的在于揭示整个酶解过程抗氧化寡肽的释放规律,并通过酶促胁迫外源氨基酸修饰技术进一步提高抗氧化寡肽活性,对修饰产物进行了分离纯化和分离组分的抗氧化活性评价,为提高其潜在的应用价值奠定基础,也为其它活性肽的深度开发提供参考。主要的研究结果如下:(1)以水解度、DPPH自由基和羟自由基清除率为评价指标,选用碱性蛋白酶、胃性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶筛选实验,其中碱性蛋白酶酶解产物的水解度、DPPH自由基和羟自由基清除活性显著高于其他三种蛋白酶(P<0.05),因此选择碱性蛋白酶作为实验用酶;通过单因素试验和响应面试验优化酶解工艺,确定最优工艺条件为:温度55°C、加酶量3300U/g(波纹巴非蛤肉)、时间220min。(2)以整个酶解过程的水解度和自由基清除率变化情况,建立了波纹巴非蛤一级水解动力学方程:DH=12.20ln(t+31.48)-42.59,R2=0.9874;对整个酶解过程的分子量分布(HPSEC)进行统计,建立了一级寡肽的释放动力学方程:Q=59.655[1-exp(-0.0098(t+96.42))],(Mr<3000Da,R2=0.9673),寡肽释放常数为0.0098,说明寡肽的释放是一个较为缓慢的过程;结合肽谱和质谱图分析得到:随反应时间的延长,低分子量寡肽含量增多,疏水性多肽种类增多,活性增加。220min之后,因小于3000Da分子量肽的继续被酶解,某些活性片段或序列被切断,导致活性下降。(3)以游离氨基酸减少量、DPPH自由基和羟自由基清除率为评价指标,通过酶筛选试验选用木瓜蛋白酶为酶促胁迫修饰反应试验用酶,选用半胱氨酸:赖氨酸=3:7为实验用氨基酸;通过单因素试验和响应面试验优化酶促胁迫修饰工艺,确定最优工艺条件为:酶添加量3800 U/g,氨基酸添加量0.56 g/g(底物游离氨基酸),反应温度34℃。(4)对比外源氨基酸酶促胁迫修饰底物和产物的抗氧化活性,发现经修饰后产物的DPPH自由基和羟自由基清除率分别从反应前底物的38.67%和38.60%提升至90.24%和50.44%(2 mg/m L多肽浓度),活性有了显著的提高(P<0.05)。肽谱和质谱分析结果表明,酶促胁迫修饰反应后产物中3kDa5kDa分子量肽含量并未出现明显下降,而1kDa3kDa分子量肽的含量有了大幅度的提高,产物分子量在整体上减小,且酶促胁迫修饰反应使得产物中肽种类增多,生成了新的抗氧化肽类。(5)Sephacryl S-100对外源氨基酸修饰产物的分离效果更好,且分离出P1-P4四个峰,其中峰P2的其分子量范围是9225-521Da,抗氧化活性最高,DPPH自由基和羟自由基清除率分别为82.16%和41.63%(2 mg/mL多肽浓度)。
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