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背景:恶性肿瘤因高发病率和死亡率严重危害人类的生命健康。目前常用的治疗方式有手术、化疗和放疗等,但针对晚期患者治疗效果差且容易复发。近年来,利用机体免疫系统攻击肿瘤细胞的免疫疗法成为治疗恶性肿瘤极具前景的研究方向之一。其中嵌合抗原受体T细胞（Chimeric antigen receptor T cells,CAR-T cells）成为继手术、化疗和放疗后的新型治疗方法。CAR-T已经在治疗靶向CD19的B细胞淋巴瘤取得了较好的临床效果。但在实体瘤治疗效果却有限,原因主要有难以找到针对实体瘤理想的靶点、免疫抑制性的肿瘤微环境、CAR-T细胞的浸润性差以及进入实体肿瘤后的持久性差等。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）,属于肿瘤坏死因子超家族成员,其受体TRAIL-R1在多种肿瘤细胞上高表达,正常细胞低或不表达,TRAIL能通过与受体TRAIL-R1结合诱导肿瘤细胞凋亡。课题组前期研究已成功制备全人源的TRAIL-R1的单克隆的抗体(TR1419),并验证了其能靶向杀伤表达TRAIL-R1的肿瘤细胞。本研究拟探讨以TRAIL-R1为靶点的CAR-T细胞不仅能通过胞外区TRAIL-R1杀伤肿瘤细胞,而且可通过CAR信号激活T细胞作用诱导肿瘤细胞凋亡的双重杀伤作用及其机制。本研究将为CAR-T细胞的肿瘤免疫治疗提供研究基础。目的:（1）本研究旨在构建一种优化的CAR-T细胞,以TRAIL-R1为靶点的CAR-T细胞不仅能通过TRAIL-R1途径诱导肿瘤细胞凋亡,而且通过CAR信号激活T细胞介导对肿瘤细胞的双重杀伤。（2）比较二代和三代CAR-T细胞对靶抗原的灵敏度及在靶抗原刺激后CAR-T细胞的增殖,以及CAR-T细胞的功能及表型影响。方法:（1）利用基因工程技术,将TR1419-CAR序列克隆进慢病毒表达载体p WPXL,分别构建含有CD28或CD137（4-1BB）共刺激域的TR1419-28ζ和TR1419-BBζ的二代CAR质粒,同时包含CD28和4-1BB两个共刺激域的TR1419-28BBζ三代CAR质粒,并构建包含CD8α铰链区、CD28跨膜区和截断CD3ζ的sc Fv的质粒TR1419.Δζ作为对照组。构建TRAIL-R1截断（不含DD死亡结构域）和TRAIL-R1全长的质粒。（2）利用二代慢病毒系统,制备含CAR基因的慢病毒,并感染活化T细胞和Jurkat细胞,制备二代TR1419-28ζ、TR1419-BBζ和三代TR1419-28BBζCAR-T细胞和TR1419-BBζ-Jurkat细胞以及TR1419.Δζ-T细胞和TR1419.Δζ-Jurkat细胞。（3）流式细胞术检测TR1419-CAR感染率、表型和抑制性分子的表达特征。实时无标记细胞分析仪（Real Time Cellular Analysis,RTCA）和钙黄绿素染色法（Calcein-AM,CAM）检测TR1419-CAR胞外区对肿瘤细胞的杀伤。酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays,ELISA）检测杀伤上清中效应细胞因子IFN-γ、颗粒酶B（Granzyme B）的分泌。使用荧光染料CFSE标记染色并通过流式细胞术检测TR1419-CAR-T细胞与肿瘤细胞共孵育后TR1419-CAR-T细胞的增殖。（4）通过Annexin V/7-AAD双染色流式细胞术检测TR1419-28BBζ-Jurkat细胞和TR1419.Δζ-Jurkat细胞与靶细胞共孵育后肿瘤细胞凋亡以及胞内Caspase-3的表达。结果:（1）成功构建嵌合抗原受体表达质粒p WPXL-TRAIL-R1-CAR及相关质粒并制备靶向TRAIL-R1的二代TR1419-28ζ、TR1419-BBζCAR-T细胞、三代TR1419-28BBζCAR-T细胞、TR1419.Δζ-T细胞、TR1419-28BBζ-Jurkat细胞、TR1419.Δζ-Jurkat细胞。并证明了TR1419-28BBζCAR-T细胞能杀伤表达TRAIL-R1的肿瘤细胞并伴随着明显的效应细胞因子IFN-γ和颗粒酶B分泌。（2）TR1419.Δζ-Jurkat细胞和TR1419-28BBζ-Jurkat细胞分别与靶细胞共孵育后均能检测到靶细胞中凋亡分子Annexin V/7-AAD的表达（24.9%和25.3%）,以及胞内凋亡蛋白Caspase-3的表达（46.9%和40.9%）,加入TRAIL-R1-Fc融合蛋白阻断后凋亡被抑制。（3）TR1419-28BBζCAR-T细胞和TR1419.Δζ-T细胞均不能诱导TRAIL-R1阴性的293T细胞发生凋亡且不分泌效应细胞因子,TR1419.Δζ-T细胞细胞对表达TRAIL-R1截断的293T细胞没有显著的杀伤作用和效应细胞因子的分泌,但TR1419-28BBζCAR-T对表达TRAIL-R1截断细胞具有显著的杀伤作用和IFN-γ和颗粒酶B的分泌,TR1419-28BBζCAR-T细胞和TR1419.Δζ-T细胞均能有效杀伤表达TRAIL-R1全长的293T细胞,而TR1419-28BBζCAR-T细胞与TR1419.Δζ-T细胞相比显示出更高的特异性杀伤,TR1419.Δζ-T细胞不能检测细胞因子分泌,而TR1419-28BBζCAR-T细胞有较高的细胞因子分泌。（4）与二代TR1419-28ζ和TR1419-BBζCAR-T细胞相比,三代TR1419-28BBζCAR-T细胞在靶抗原刺激后增殖更快,在相同浓度靶抗原刺激下（0.05ug/m L）表现出更高的活化分子CD137的表达,免疫抑制性分子（Programmed death-1,PD-1）表达略有升高（10%）。两个二代TR1419-28ζ和TR1419-BBζCAR-T细胞和三代TR1419-BBζCAR-T细胞杀伤作用和表型分布比较未有明显差异。结论:（1）本研究发现靶向TRAIL-R1的TR1419-CAR-T细胞对肿瘤细胞具有较强的双重杀伤作用。其作用机制是TR1419-CAR-T细胞不仅通过激活TRAIL-R1死亡受体依赖性凋亡信号通路介导肿瘤细胞凋亡,而且通过CAR信号激活T细胞介导对靶细胞的杀伤。（2）与二代TR1419-CAR-T细胞相比,三代TR1419-28BBζCAR-T细胞对靶抗原有更高的灵敏性,且在靶抗原刺激后增殖更活跃,免疫抑制性分子PD-1水平表达增加。本研究为后续靶向TRAIL-R1的CAR-T细胞治疗提供研究基础,同时为其他CAR-T细胞的优化设计提供了一种新思路。