猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)为有囊膜的单链正股RNA病毒,属于尼多病毒目动脉炎病毒科,主要引起母猪早产、流产等繁殖障碍,仔猪、育肥猪呼吸困难及育成猪类流感疾病,并可持续性感染,引起免疫抑制,已经成为危害世界养猪业安全的重要病原之一。近年来,高致病性PRRSV的出现,对中国养猪业造成了巨大的损失。然而,目前使用的PRRSV疫苗只能够提供部分的保护力,阻止临床症状的出现,却不能防治PRRSV感染,另外不同毒株间的交叉保护力也较低,研究新型防控策略是分有必要。RNA干扰(RNAi)是由小干扰RNA (small interference RNA, siRNA)引发的信使RNA (mRNA)序列特异性消减现象,在真核生物细胞具有基因表达调控的作用,同时又是一种保守的抗病毒机制。siRNA是19-27nt的小分子双链RNA片段,可以由体外转录或载体DNA转录的发夹RNA (short hairpin RNAs, shRNAs)得到。siRNA可以抑制同源的内源或病原mRNA的表达。近年RNAi技术已被用于干扰抑制多种人或畜类病毒的复制和感染研究,提示RNAi作为一个有效的抗病毒策略,具有很大应用前景。本实验室利用pSUPER质粒介导PRRSV特异性shRNA可以有效抑制病毒在MARC-145中的复制增殖。本研究构建了表达靶向PRRSV不同基因和不同病毒受体基因shRNA的表达质粒及重组腺病毒,并在体外和体内对表达的shRNA抑制病毒复制和目的基因表达的效果进行了评价。本研究内容分为以下6个部分：1.PRRSV基因SYBR Green real-time PCR检测方法的建立针对PRRSV S1株和SY0608株的ORF1b基因设计了real-time PCR引物,通过优化反应条件,建立了real-time PCR检测ORF1b基因表达水平的方法。结果表明,建立的real-time PCR方法具有很好的敏感性、特异性和重复性,对PRRSV细胞培养物的检测下限为10～100TCID50。2.靶向ORF1b shRNA重组质粒在MARC-145细胞对PRRSV复制的抑制作用将靶向PRRSV ORF1b shRNA的重组质粒pSUPER-P2和pSUPER-P3分别转染MARC-145田胞,24h后再感染相同剂量PRRSV,感染PRRSV 48h或72h,采用TCID50, real-time PCR和IFA方法分别检测shRNA重组质粒对PRRSV复制的抑制效果,探明抑制机制。结果为,MARC-145细胞转染pSUPER-P2或pSUPER-P3后,接种PRRSV细胞病变(CPE)明显减轻,病毒TCIDso滴度比PRRSV对照组细胞中的病毒量降低了约100倍；PRRSV ORF1b mRNA和ORF1b蛋白水平比对照明显降低(p<0.05)。证明靶向ORF1基因的shRNA表达质粒能够在MARC-145细胞中有效抑制PRRSV的复制。3.靶向PRRSV不同基因的shRNA重组腺病毒的构建与鉴定将重组pSUPER (pSUPER-N3, pSUPER-G1, pSUPER-P2和pSUPER-P3)质粒中的PH1-shRNA表达框经PCR扩增后,隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMVPCMV启动子下游,重组穿梭载体测序鉴定后,与腺病毒骨架载体共转化BJ5183感受态细胞,获得shRNA腺病毒重组载体。再将重组腺病毒载体经PacI线性化后转染HEK-293A细胞,获得表达针对PRRSV不同阅读框shRNA的重组腺病毒rAd-N3 (ORF7), rAd-G1 (ORF5), rAd-P2 (ORF1b)和rAd-P3 (ORFlb)。同时构建了表达突变shRNA的重组腺病毒rAd-mN3和rAd-mP2,作为腺病毒对照。重组腺病毒接种HEK-293A细胞后72h出现CPE,荧光显微镜检查有GFP。重组病毒滴度均为1010～1011efu／mL。PCR检测重组腺病毒基因组内PH1-shRNA表达框均为阳性。4.靶向PRRSV不同基因的shRNA重组腺病毒在体外抑制PRRSV复制的效果的比较为验证上述构建的表达shRNA的重组腺病毒(rAd-shRNA)是否能够有效抑制PRRSV的复制,在MARC-145细胞上先别接种500MOI的rAd-shRNA,24小时后感染10MOI的PRRSV S1株；感染PRRSV 48小时后,观察PRRSV引起的CPE程度,并测定PRRSV的滴度；利用PRRSV N蛋白和ORF1b蛋白单克隆抗体及GP5蛋白多抗,采用间接免疫荧光(IFA)的方法检测蛋白含量,用real-time PCR的方法检测与shRNA对应的基因水平。结果表明：(1) shRNA重组腺病毒组CPE明显减轻,TCIDso滴度明显低于rAd-mN3对照组(p<0.05)；(2)与对照组相比PRRSV ORF7和ORFlb基因均被其特异性的shRNA抑制了至少100倍；(3)PRRSV N蛋白,GP5蛋白以及ORF1b蛋白的表达量与接种rAd-mN3及只感染PRRSV的对照组相比显著下降。该结果证明本研究构建的rAd-shRNA可以有效抑制PRRSV在MARC-145细胞中的复制。为了进一步研究rAd-shRNA是否能在PAM原代细胞中抑制PRRSV复制,在PAM细胞上,按照上述方法接种同样剂量的rAd-shRNA和PRRSV,感染PRRSV 48小时,先观察CPE,用N蛋白单抗检测病毒含量的同时采用real-timePCR的方法分别检测细胞中N蛋白基因的水平,并测定病毒滴度。结果证明：(1)与对照组比,4个靶向PRRSV不同基因shRNA的重组腺病毒,均可以在PAM中有效抑制PRRSV S1株的复制,抑制效力为100～1000倍左右；(2) shRNAs对PRRSV的复制抑制作用随着时间的延长而逐渐减弱；(3) shRNAs对PRRSV的复制抑制作用具有明显的剂量依赖性,即抑制效力随着rAd-shRNA接种剂量的增加而增强；(4)PAM感染PRRSV后再接种rAd-shRNA或同时感染两种病毒时,rAd-N3、rAd-G1、rAd-P2和rAd-P3仍然能够有效地抑制病毒复制。5.靶向PRRSV ORFlb的shRNA重组腺病毒在体内外抑制高致病性PRRSV复制抑制效果研究选取靶向PRRSV ORFlb的2个重组腺病毒,按上述同样方法在MARC-145细胞上观察其抑制PRRSV传统毒株S1和高致病性毒株SY0608复制效果。结果表明,与表达突变shRNA的rAd-mP2对照组以及PRRSV接毒对照组相比,rAd-P2对S1株和SY0608株的复制均具有明显的抑制作用；而rAd-P3只能有效抑制S1株复制,对SY0608株的抑制作用不明显。选取PRRSV阴性猪,制备PAM细胞,用上述同样方法进一步观察rAd-P2抑制SY0608株复制效果。结果显示,rAd-P2可以有效抑制PRRSV细胞病变的产生；与对照相比,PRRSV N蛋白以及细胞内ORFlb mRNA水平均明显降低(p<0.05),且该抑制作用具有剂量依赖性,并随时间的延长逐渐减弱。选取20头6周龄PRRSV阴性仔猪,分成4组,每组5头。第1和2组分别肌肉注射rAd-P2和rAd-mP2,4×109TCID50／头,24小时后第1～3组分别肌肉注射PRRSV SY0608株(2×104.0TCID50／头),第4组作为正常对照；接种后隔离饲养观察,每日测量体温和采血。接种PRRSV后第9天,将所有猪只宰杀,进行病理学观察和PRRSV real-time PCR检测。结果为,(1)临床症状：rAd-mP2组和攻毒对照动物,攻毒后第3天起出现体温升高(40.0～42℃),并出现食欲不振,嗜睡,呼吸困难,皮肤发红,眼睑水肿,轻微腹泻和背毛杂乱等临床症状,而rAd-P2组的动物攻毒后第6天才出现体温升高,症状轻于对照组(40.0～41℃),在攻毒后第8天,3头动物出现轻微的临床症状；(2)病理学观察：]Ad-P2组动物的肺部病变明显轻于对照组动物,其中只有3头猪的肺有轻微的间质性肺炎,其余两头猪肺外观无明显病理损伤。肺组织病理切片观察显示,rAd-mP2组和攻毒对照组动物的肺组织出现明显的间质性肺炎,如肺泡壁增厚,单核巨噬淋巴细胞浸润和支气管渗出物增多,而rAd-P2组仅3头动物肺组织出现了轻微的微观病理损伤；(3)病毒血症：对攻毒后第1天和第5天的血清中病毒含量检测,结果显示,攻毒后第5天时rAd-P2组动物的病毒血症与对照组相比,被明显抑制(p<0.05)；(4)肺组织中PRRSV检测：rAd-P2组动物肺组织中病毒的平均含量同样明显低于对照组(p<0.05)。该结果表明,rAd-P2表达的shRNA可以在猪体内外有效抑制PRRSV的复制,并推迟动物发病至少3天时间。证明腺病毒载体介导的shRNA在体外和体内均能有效抑制PRRSV的复制,为控制PRRSV感染提供了一种可能的新策略。6.表达靶向PRRSV受体基因shRNA重组质粒和重组腺病毒的构建与鉴定根据CD151、CD163和CD169(唾液酸黏附素)的基因序列分别设计引物,将扩增的基因片断克隆于pEGFP-N1载体,获得3个EGFP融合表达质粒。并以CD151、CD163和CD169基因为靶基因,设计合成具有小发夹结构的寡核酸序列,经退火成互补双链后,克隆于pSUPER质粒中；利用PCR技术扩增PH1-shRNA表达框,再克隆入重组腺病毒载体,获得表达shRNA的重组腺病毒rAd-151-1和rAd-151-2, rAd-163-1和rAd-163-2、rAd-169-1和rAd-169-2.将shRNA重组质粒与构建的融合表达质粒两两共转染HEK-293A细胞,分别在转染后72小时观察荧光表达情况。结果shRNA质粒共转染细胞中的荧光表达与对照细胞相比均有不同程度的减弱,或表达荧光细胞数的减少。将表达shRNA的重组腺病毒接种PAM细胞,利用CD163和CD169的单克隆抗体检测PAM细胞中相应受体蛋白水平,结果显示实验组荧光细胞数和银光强度低于对照组；将重组腺病毒分别接种PAM后24h,再感染PRRSV S1毒株,24h后检测PRRSV TCID50滴度,结果与对照组无明显差异,针对PRRSV多细胞受体shRNA重组腺病毒联合作用,有待进一步研究。