【摘 要】
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为获得中国人的芳香族左旋氨基酸脱羧酶(AADC)基因,该研究从胎儿黑质组织中提取总RNA,以RT-PCR方法扩增目的cDNA片段,经初步酶切鉴定后,将这一片段克隆于pGEM-T载体中进行全
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为获得中国人的芳香族左旋氨基酸脱羧酶(AADC)基因,该研究从胎儿黑质组织中提取总RNA,以RT-PCR方法扩增目的cDNA片段,经初步酶切鉴定后,将这一片段克隆于pGEM-T载体中进行全序列分析;再将此cDNA片段从pGEM-T载体上酶切下来,补平后亚克隆到经酶切、初平和脱磷处理的pBK-RSV载体中,经酶切鉴定筛选到正向连接入AADC基因的pBK-RSV-AADC质粒.用脂质体转染的方法将此质粒转染COS7细胞,得到表达AADC基因的细胞株;利用pGEM-T载体的T7和SP6启支子,合成Dig标记的AADC基因正义和反义链RNA探针,测定浓度后进行AADC基因在COS7细胞中表达的原位杂交检测;同时在保证AADC基因活性最佳的条件下,用HPLC测定加入L-DOPA后AADC转染COS7细胞DA的生成量,借以了解重组表达的AADC基因的功能活性.结果表明:该研究克隆到了编码正确的人AADC的cDNA全序列,并且在真核细胞中能自体高效表达,我们获得得转AADC基因的细胞可以用于帕金森病的基因治疗.
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