一种基于锌指融合蛋白对沙门氏菌的快速检测方法

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沙门氏菌是一种世界范围内非常常见的典型食源性致病菌,因其人畜共患、爆发率高及一旦爆发即为群体感染事件等性质,包括我国在内的绝大多数国家都做出食品中不可检出沙门氏菌的规定。然而,现行的包括我国在内的绝大多数国家针对沙门氏菌的国家标准检测方法均为传统培养法和血清鉴定法的结合,需耗费4-6天时间得出报告,极不利于沙门菌的防治。因此,许多科研工作者致力于开发针对沙门氏菌的快速检测方法,并围绕PCR、ELISA、Biosensor三种基础检测系统构建了许多种快速检测方法。本文中尝试建立一种基于蛋白质/DNA互作、糅合三种基础检测系统的针对沙门氏菌的快速检测方法:采用亲和素标记的磁珠收集以生物素标记引物、沙门氏菌为模板的PCR产物,引入一种含有识别结构域和报告结构域的融合蛋白,特异性识别结构域可以抓取PCR产物消除PCR带来的假阳性,而报告结构域可以进行信号放大,获得直观的检测结果。本文采取四个识别结构域:1个HTH型转录因子和3个锌指蛋白;两个报告结构域:绿色荧光蛋白GFP和荧光素酶。最终,成功构建了一个新的人造锌指蛋白和荧光素酶/GFP融合蛋白,并基于此建立了一种针对沙门氏菌的快速检测方法。人工设计的锌指蛋白可以特异性的结合沙门氏菌中表达毒素侵袭蛋白invA基因的一段12bp序列,融合在锌指蛋白尾端的桡足类来源的Gaussia luciferase可以直接催化底物腔肠素发光,而GFP则可以直接激发发光,以来进行报告信号的放大。利用新型的检测方法,不包括PCR步骤,我们可以在2小时内实现对沙门菌的快速检测,使用锌指一荧光素酶融蛋白其检测下限可以低至10fmol dsDNA或1-5CFU/mL的沙门氏菌。因为,使用Zinc Finger Tools等工具可以实现针对任意DNA双链片段设计出与之特异性结合的人造锌指蛋白,我们可以更换融合蛋白的锌指探头来实现对任意病原菌的快速检测,这对病原菌防治有着深远的意义,能对传统的检测方法形成有效地补充。
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