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目的：树突状细胞(dendritic cells，DCs)具有独特的刺激T细胞活化的能力，是连接非特异性和特异性免疫的桥梁。多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种中枢神经系统自身免疫性疾病，实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmune encephalomyelitis，EAE)是研究MS的经典模型。DCs作为功能最强的抗原递呈细胞，在MS及EAE发病过程中起着枢纽的作用。反义导向分子A(repulsive guidance molecule a，RGMa)作为一种膜蛋白，以往多认为其限制性表达于中枢神经系统，最新研究表明其也在免疫系统发挥作用，然而其对DCs及EAE干预功能未知。因此本研究体外诱导EAE模型，给予RGMa特异性阻断抗体干预，观察RGMa是否参与EAE模型的发生发展，及其是否可在体内调控DCs免疫功能。体外细胞实验中，DCs应用RGMa特异性阻断抗体干预，并体外给予牛膝多糖(Achyranthesbidentata polysaccharide，ABP)或脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)刺激，观察RGMa是否在体外调控DCs功能。本实验为探究RGMa在免疫系统的作用提供线索，为免疫性疾病的治疗提供新的方向。 方法：动物实验中，分为3组，分别为:空白组，给予Control IgG抗体干预EAE小鼠(Control IgG/EAE组)，给予RGMa特异性阻断抗体干预EAE小鼠（Anti-RGMa/EAE组）。体外构建EAE小鼠模型，选取合适的RGMa特异性阻断抗体作用剂量，应用侧脑室给药方法给予EAE小鼠干预。实验观察并记录各组动物发病及体重情况，并在发病高峰期，即免疫第22d收集小鼠血液及脑组织进行后续实验。对各组小鼠进行行为学评分，应用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色法观察颅内炎性浸润情况，应用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测细胞因子含量，流式细胞术检测颅内DCs表面蛋白的表达量。细胞实验中，分为5组，分别为:RPMI1640组，Control IgG抗体+ABP组(Control IgG/ABP组)，Control IgG抗体+LPS组（Control IgG/LPS组），RGMa特异性阻断抗体+ABP组（Anti-RGMa/ABP组），RGMa特异性阻断抗体+LPS组（Anti-RGMa/LPS组）。提取并纯化C57BL/6小鼠的骨髓源性的DCs，隔天半量换液，收集第5天的DCs进行实验，向每孔添加最佳浓度的RGMa特异性阻断抗体或Control IgG抗体干预，24h后，在不更换培养液的基础上，再向每孔添加ABP（10μg/ml）或LPS(20μg/ml)刺激，再培养24h后，收集细胞或上清备用。然后应用流式细胞术检测细胞凋亡，扫描电镜、透射电镜观察细胞形态，ELISA检测细胞因子分泌，流式细胞术检测细胞吞噬能力及表面蛋白表达。然后将各组DCs与T淋巴细胞共培养，应用MTS实验检测DCs诱导T细胞增殖能力，ELISA实验检测共培养体系细胞因子分泌情况。 结果：⑴在动物实验方面，选取RGMa特异性阻断抗体最佳作用剂量为15μg。⑵在各组小鼠行为学评分方面，与Control IgG/EAE组小鼠相比，从免疫第16天开始，Anti-RGMa/EAE组小鼠评分显著降低（P＜0.05）。⑶在小鼠体重方面，与Control IgG/EAE组小鼠相比，从免疫第10天开始，Anti-RGMa/EAE组小鼠体重降低程度显著下降(P＜0.05)。⑷在HE染色方面，Control IgG/EAE组脑部HE染色可见大量炎性细胞浸润，小血管扩张，血管周围可见“血管套袖”样改变，且一个视野内有多个“血管套袖”样改变，炎性评分为2.75±0.25。Anti-RGMa/EAE组小鼠脑部HE染色也可见炎性细胞浸润，但多散在分布，“血管套袖”样改变较为少见，炎性评分为1.50±0.29，评分显著低于Control IgG/EAE组(P＜0.05)。⑸在小鼠体内细胞因子分泌方面，Anti-RGMa/EAE组小鼠体内IL-2、IL-12及TNF-α含量显著低于Control IgG/EAE组（P＜0.05）。⑹在小鼠颅内DCs表面蛋白表达方面，与Control IgG/EAE组相比，Anti-RGMa/EAE小鼠颅内DCs MHCⅡ，CD86，CD80和CD40的表达量显著降低(P＜0.05)。⑺细胞实验中，选取RGMa特异性阻断抗体最佳作用浓度为10μg/ml。⑻在DCs凋亡方面，与Control IgG/ABP组相比，Anti-RGMa/ABP组并无显著变化(P＞0.05);与Control IgG/LPS组相比，Anti-RGMa/LPS组也无显著变化(P＞0.05)。⑼在细胞形态方面，透射电镜可见，RPMI1640组、Anti-RGMa/ABP组与Anti-RGMa/LPS组DCs胞内可见大量的吞噬小泡及溶酶体，但内质网及线粒体等细胞器含量较少。与此相对的，Control IgG/ABP组与Control IgG/LPS组DCs胞内有较多的内质网、高尔基体及线粒体，然而吞噬小泡及溶酶体较少。扫描电镜观察可见，RPMI1640组、Anti-RGMa/ABP组与Anti-RGMa/LPS组DCs胞体较小，表面突起较少。然而Control IgG/ABP组与Control IgG/LPS组DCs形态多种多样，胞体较大，表面多有树枝样突起，粗细不均。⑽在DCs表面蛋白表达方面，与Control IgG/ABP组相比，Anti-RGMa/ABP组DCs表面MHCⅡ，CD86，CD80和CD40的表达量显著降低(P＜0.05)。与Control IgG/LPS组相比，Anti-RGMa/LPS组DCs表面MHCⅡ，CD86，CD80和CD40的表达量也显著降低(P＜0.05)。⑾在DCs细胞因子分泌方面，与Control IgG/ABP组相比，Anti-RGMa/ABP组DCs IL-12，IL-1β及TNF-α的分泌量显著降低，IL-10的分泌量显著升高(P＜0.05)。与Control IgG/LPS组相比，Anti-RGMa/LPS组DCsIL-12，IL-1β及TNF-α的分泌量显著降低，IL-10的分泌量显著升高(P＜0.05)。⑿在检测DCs吞噬能力方面，与Control IgG/ABP组相比，Anti-RGMa/ABP组DCs吞噬能力显著升高（P＜0.05）。并且，Anti-RGMa/LPS组DCs吞噬能力相比于Control IgG/LPS组，也存在较大程度的提高(P＜0.05)。⒀在诱导T细胞增殖及分化能力方面，当DCs与T细胞共培养比例为1∶1及1∶10时，Anti-RGMa/ABP组DCs诱导T细胞增殖能力相比于Control IgG/ABP组，存在较大程度的降低(P＜0.05)。与Control IgG/LPS组相比，Anti-RGMa/LPS组DCs诱导T细胞增殖能力也显著降低(P＜0.05)。当DCs与T共培养细胞比例为1∶1，相比于Control IgG/ABP组，Anti-RGMa/ABP组共培养体系中IL-2及IFN-γ含量显著降低(P＜0.05)，而IL-10及IL-13含量显著升高(P＜0.05)。类似的情况也存在于Anti-RGMa/LPS组，与Control IgG/LPS组相比较，共培养体系中IL-2及IFN-γ含量显著降低(P＜0.05)，而IL-10及IL-13含量显著升高(P＜0.05)。 结论：①RGMa参与小鼠EAE发病，并可在体内调控DCs的免疫功能。②RGMa在体外参与调控DCs的免疫功能，特异性阻断抗体干预后的DCs具有耐受性及免疫调节性。