猪瘟是具有高度传染性的病毒性疾病,是养猪业危害最严重的疾病之一。其病原为猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV),该病毒为具有囊膜的正链RNA病毒,基因组长度大约12.3 kb,包含5’和3’端非翻译区,编码一条含有3898个氨基酸的肽链,能够被剪切为12个蛋白,其中4个为结构蛋白(C、Erns、E1和E2)和8个为非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。在结构蛋白中,E2被认为是CSFV的主要保护性抗原。基于E2基因的CSFV基因分型结果显示,流行毒株已经从基因型1转变为基因型2,表明主要抗原基因正在逐步发生变异。有研究表明,E2蛋白单点氨基酸的突变可能影响E2蛋白的抗原性,进而改变E2蛋白与抗体反应性,大部分影响中和反应差异性的重要抗原特异性氨基酸残基位于B/C抗原结构域上。然而,有关E2基因变异是否影响CSFV弱毒疫苗的免疫效果鲜见研究。本研究试图通过原核和杆状病毒系统表达基于流行毒株E2高变区AR3的突变蛋白,系统分析它们与疫苗C株高免血清的反应性及其对C株免疫猪外周血单核细胞的激活效应,以此阐明流行毒株E2蛋白变异对C株疫苗免疫效果的潜在影响。原核表达属于基因2型CSFV流行毒株QZ-07与HZ1-08的E2抗原结构域(AD和BC区),与疫苗C株免疫的猪血清反应性显著低于相同区域的C株E2片段(P<0.05)。通过基因1型和2型E2蛋白分析发现,E2抗原结构域包含3个高变抗原区(Antigenic region, AR)。我们通过对商业的杆状病毒表达系统进行改造,制备了疫苗C株、流行毒株QZ-07和HZl-08不包含跨膜区的截短E2蛋白,以及以C株E2为骨架分别嵌合流行毒株3个AR区的重组嵌合蛋白。ELISA和免疫印迹分析结果显示,C株E2嵌合流行毒株AR3的重组蛋白在所有重组嵌合蛋白中反应性最差(P<0.05)。另外,为了检验流行毒株E2不同抗原区对C株疫苗免疫产生的细胞介导免疫影响,我们用不同的重组E2蛋白刺激C株疫苗免疫的猪外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)。通过ELISPOT和流式细胞术分析,我们发现C株E2嵌合不同流行毒株抗原区的重组蛋白在刺激PBMC分泌抗体和分泌IFN-γ能力上没有显著的区别。上述结果表明,E2蛋白主要诱导体液免疫,C株疫苗血清与基因2型流行毒株的E2蛋白反应性有显著差别,这种差别可能主要来自于AR3的变异。为了进一步探索AR3的变异在E2蛋白与C株疫苗诱导的体液免疫之间的关系,我们选取了AR3区的10个差异显著的氨基酸位点,利用杆状病毒表达系统制备了以C株E2为骨架、分别携带流行毒株单一氨基酸置换的10个突变E2蛋白。免疫印迹结果显示,不同突变蛋白之间及其与C株E2蛋白之间对C株血清的反应性差异并不明显。ELISA分析结果表明,相对于C株E2蛋白所有重组突变蛋白与C株免疫猪血清反应能力都有降低,其中以E37N和V45Q(以AR3区域的氨基酸位置)反应能力降低更为显著(P<0.05),表明这两个氨基酸可能与E2蛋白的构象相关。以上结果表明,基因型2的流行毒株E2蛋白抗原区变异影响其对C株疫苗的血清反应性,其中以AR3区的影响尤为明显；AR3区的E37N和V45Q两个位点置换显著降低其与C株高免血清的反应性,表明这些氨基酸可能介导了E2蛋白的构象变化。本研究结果为猪瘟疫苗的改良和基于E2蛋白亚单位疫苗的研制提供了基础。