肿瘤转移相关蛋白(Metastasis-associated proteins,MTAs)是核小体重塑并脱乙酰化复合物(Nucleosome remodeling and histone deacetylase,NuRD)的重要组份。该家族主要成员包括MTA1、MTA2和MTA3,分别由三个定位于不同染色体的基因编码,并通过NuRD依赖或非依赖的方式来调节靶基因的表达,发挥生物学效应。MTA1是此家族中发现最早和研究最多的分子。近年来大量研究表明,MTA家族在多种人类恶性肿瘤中高表达,且参与肿瘤的发生、发展和转移,调控众多细胞内信号途径。然而,MTA家族成员在正常细胞和组织中也广泛表达,尤其在脑、肺、睾丸等组织中高表达,其表达水平影响细胞诸多基本生理功能。我们前期研究发现,MTA1敲除小鼠出生后一周内有超过1/3仔鼠死亡,死亡仔鼠肺泡间隔毛细血管发育表现出明显异常,提示MTA1在肺的发育成熟过程中具有重要作用,但具体机制仍不明确。低氧(Hypoxia)是所有实体瘤的重要模式,能够促进肿瘤血管生成、侵袭和转移。低氧诱导因子1(Hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是一种低氧应答转录因子,由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成,在调节血管发育、正常肺泡的发育、防止肺泡损伤以及促进肺损伤后肺泡再生上发挥重要作用。HIF-1α的含量受氧分压调控,并在正常氧条件下迅速降解。氧分压和血管生成是肺发育的关键调控环节,而细胞内HIF-1α是血管生成过程中对有效氧分减少做出稳态应答的主要转录因子。肺部毛细血管发育是正常肺泡发育的先决条件,是一个复杂、多步骤、受一系列血管发育相关因子严格调控的过程。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)在血管生成和血管通透性调控方面发挥关键性的作用,其主要作用于血管形成早期,促进原始血管网形成。VEGF在肺部高表达,且参与稳态的形成与调控,在胚胎发育过程中,肺VEGF的水平对肺部形成至关重要。既往研究显示,肺毛细血管发育障碍会导致微循环发生障碍,致肺血流阻力增加,促使肺动脉高压发生、发展,进而导致支气管肺发育不良(Bronchopulmonory dysplasia,BPD)、肺气肿和呼吸窘迫综合征(Respiratory distress syndrome,RDS)等不良肺部疾病发生。最近研究表明,MTA1与肿瘤血管形成(Angiogenesis)显著相关,且通过调控HIF-1α促进血管形成。MTA1通过HDAC1招募介导HIF-1α乙酰化,从而增强HIF-1α稳定性;MTA1还可通过增强HIF-1α转录活性提高VEGF表达,促进肿瘤血管生成;而VEGF转录受到HIF-1α的调控。这些结果提示MTA1是一种活跃的血管生成调节因子,通过与HIF-1α直接相互作用,使HIF-1α乙酰化,并在稳定HIF-1α方面发挥重要作用。因此,MTA1、HIF-1α、VEGF及其受体在血管发生和血管形成过程中发挥重要作用。研究目的:以MTA1敲除小鼠为研究对象,深入了解MTA1在肺毛细血管发育过程中的作用,并从组织和分子水平着力阐明MTA1敲除对小鼠肺部发育的具体影响和相关分子机制。研究方法:1.采用Western blot,定量PCR和免疫组化染色检测了MTA1在小鼠的组织分布和肺发育过程中动态变化;通过出生后死亡分析和体重监测等,确定MTA1敲除对小鼠出生后存活率,体重变化等发育情况的影响;通过对MTA1敲除小鼠肺组织发育形态学进行研究,确定MTA1缺失对小鼠存活情况以及肺发育的影响。2.分析2月龄野生型和MTA1敲除小鼠的心脏组织,以及心肌细胞横截面积;利用免疫组化分析肺动脉壁α-SMA的表达水平。分别采用Heme染色和电镜等方法和技术,确定MTA1缺失对小鼠肺泡壁毛细血管发育和成熟的影响;通过免疫组织化学染色、定量PCR和Western blot等方法,分析CD31、CD34、ERG、HIF-1α和VEGF等在野生型和MTA1敲除胎鼠(E18.5)和2月龄成年小鼠肺组织中的表达情况,明确MTA1在小鼠肺毛细血管形成和成熟过程中的作用。3.用携带过表达MTA1或MTA1特异性si RNA重组质粒转染细胞,采用Real-time PCR和Western blot等方法检测MTA1和HIF-1α、VEGF表达变化,进一步探讨MTA1对肺部毛细血管床发育调控的分子机制。研究结果:1.MTA1缺失导致小鼠生存率降低且发育迟缓。Western blot结果显示,MTA1在成年小鼠睾丸、卵巢、肾脏、肺、肝和乳腺组织中表达水平均较高;同时免疫组化、Real-time PCR和Western blot结果显示,MTA1在各个发育阶段的小鼠肺组织中均有表达,且在E16.5小鼠肺组织中表达最丰富,出生后肺部MTA1表达水平逐渐降低,2月龄小鼠肺组织中表达最少。对E18.5和出生后7天小鼠生存情况分析显示,MTA1敲除小鼠出生后7天内有超过1/3仔鼠死亡,死亡仔鼠肺泡间隔毛细血管发育有明显异常。此外,存活的MTA1敲除小鼠体重增加速度明显降低。这些结果表明,MTA1缺失能够增加小鼠出生后死亡率和减缓发育速度。组织学分析的结果显示,MTA1敲除小鼠的肺在E18.5天、出生后1天和出生后2月均具有明显的发育异常,表现为肺泡壁增厚,细胞数量增加等。这些结果提示,MTA1可能参与小鼠肺发育和成熟过程。2.MTA1缺失导致小鼠肺泡间隔毛细血管发育阻滞和肺动脉高压。对2月龄MTA1敲除小鼠的研究发现,与野生型组小鼠对比,MTA1敲除小鼠心脏体积明显增加,且心脏重量与体重之比(HW/BW)明显升高。对心肌细胞横截面积进行分析,结果显示MTA1敲除小鼠右心室壁细胞的横截面积显著高于野生型小鼠(P<0.05),表明MTA1缺失导致小鼠右心心肌肥大。通过HE染色、Heme染色以及透射电镜等技术,观察不同发育阶段MTA1敲除小鼠肺泡间隔毛细血管的形态学变化。免疫组化结果显示,MTA1敲除并未明显影响肺泡壁CD31和CD34阳性细胞的数量,但ERG阳性细胞数量明显增多,且Heme染色和电镜结果显示MTA1缺失小鼠肺泡壁中开放的毛细血管数量和血管内红细胞的数量均显著减少。这些结果表明,MTA1缺失导致小鼠肺泡间隔成熟的毛细血管数量明显减少,提示MTA1参与肺泡间隔毛细血管床发育和成熟进程。3.MTA1通过稳定HIF-1α调控肺部毛细血管发育。为了进一步证实MTA1缺失对肺泡毛细血管发育的主要机制,我们先采用免疫组化染色、Real-time PCR和Western blot方法检测了E18.5天野生型和MTA1敲除小鼠肺组织中HIF-1α和VEGF的表达情况。结果显示,在E18.5天MTA1敲除小鼠肺组织中HIF-1α和VEGF的表达均显著低于野生型小鼠。在此基础上,我们在293T细胞和小鼠MLE-12细胞中过表达MTA1和在293T细胞中沉默MTA1,观察对血管生成相关因子的影响。Real-time PCR和Western blot结果显示,过表达MTA1能够提高细胞内HIF-1α和VEGF的蛋白和mRNA水平,而沉默MTA1能够显著下调HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白水平。这些结果提示MTA1能够稳定细胞内HIF-1α水平,参与调控肺泡毛细血管的成熟。结论:MTA1通过稳定细胞内HIF-1α,影响VEGF等关键分子表达,参与调控小鼠肺泡毛细血管床的发育成熟过程。MTA1缺失导致小鼠肺泡毛细血管成熟异常,造成肺动脉高压和心肌肥厚,导致出生后死亡。本研究结果为认识MTA1的生理功能提供了实验依据,也为认识肺泡毛细血管的发育和成熟提供研究基础。