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蔷薇科(Rosaceae):Pyfinae业族(之前的苹果亚科Maloideae)植物,广泛分布于北半球温带到业热带。本亚族中的许多种是著名的水果或观赏植物,具有很高的经济价值。然而与此不相适应的是,到目前为止,这类植物的抗病机制仍然不清楚,抗病育种工作在很大程度上是靠经验和运气。联苯(biphenyl)和氧芴(dibenzofuran)是Pyrinae亚族植物在受到微生物感染后特异性产生的主要植保素。近年来,虽然关于这类化合物植物化学和生物合成方面的研究均取得一定的成果,但仍有许多问题尚待解决。为此,本文围绕欧洲花楸(Sorbusaucuparia L.)悬浮细胞中联苯和氧芴生物合成途径及其诱导机制开展了以下两个方面的工作:
⑴联苯和氧芴诱导合成过程中的信号传导机制研究。多种生物诱导子,包括蔷薇科Pyrineae亚族植物常见的苹果黑星病病原菌(Venturia inaequalis)提取物和火烧病病原菌(Erwinia amylovora)均能够诱导欧洲花楸悬浮细胞产生联苯和氧芴。其中酵母提取物(Yeast extract,YE)的诱导效果最好。联苯合成分支的第一个关键酶——联苯合酶(biphenyl synthase,BIS),其基因在对照组(未受诱导子诱导)欧洲花楸悬浮细胞中并不表达,而添加YE诱导后子后仅1小时,该基因便开始表达。6小时后,在欧洲花楸悬浮细胞提取物中可以检测到主要联苯化合物aucuparin的积累。表明生物诱导子YE能够快速诱导联苯和氧芴的从头合成(de novo synthesis)。欧洲花楸悬浮细胞受到诱导后,很快就能检测到内源活性氧迸发和内源茉莉酸(jasmonic acid,JA)的积累,但是另外一常见的信号分子一氧化氮(Nitricoxide,NO)含量在诱导后没有变化。此外,外源添加的活性氧合成抑制剂碘二苯(diphenylene iodonium,DPI)、二乙胺基二硫代甲酸钠(Diethyldithiocarbamicacid sodium salt,DIECA)及活性氧清除剂还原型二氢硫辛酸(dihydrolipoic acid,DHLA)可以完全抑制欧洲花楸悬浮细胞中联苯和氧芴的诱导合成,并在很大程度上抑制BIS基因的表达；外源添加JA合成抑制剂去甲二氢化愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid,NDGA),布洛芬(Ibuprofen,IBU)及菲尼酮(Phenidone)能够部分抑制欧洲花楸悬浮细胞中联苯和氧芴的诱导合成；外源添加NO清除剂cPTIO(4-(carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide)则完全不能对欧洲花楸悬浮细胞中联苯和氧芴的诱导合成产生影响。这些研究结果表明活性氧在联苯合成途径的活化过程中起了非常关键的信号作用；JA也起到一定的信号作用,很可能是位于活性氧下游的中间信号之一；NO不是YE诱导欧洲花楸联苯途径活化过程中的信号分子,但由于外源添加NO供体硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)可以诱导氧芴的合成,提示NO可能能够通过其它信号对联苯和氧芴合成产生诱导作用。本实验所选用的三类活性氧抑制剂作用机理有所不同,其中DIECA能抑制SOD的活性,使O2-在细胞内处于较高水平,但抑制其转化为H2O2；DPI可以抑制NADPH氧化酶的活性,阻碍O2-的形成,进而使内源H2O2的水平极低；而DHLA作为活性氧的清除剂,可以在一定程度上同时抑制内源O2-及H2O2的积累。在受YE诱导的欧洲花楸悬浮细胞体系中外源施加这三类抑制剂后,可以使原本活化的联苯生物合成途径重新被抑制。上述结果表明在联苯的诱导合成中,由外源诱导子引起的活性氧信号必须转变为H2O2才能活化联苯代谢途径。但外源直接添加不同浓度的H2O2并不能诱导联苯和氧芴的合成。说明只有内源的H2O2才活化联苯合成途径。
⑵欧洲花楸甲基转移酶基因的克隆及表达。联苯和氧芴的生物合成途径是苯丙烷代谢途径的一个新的分支。已经证明,该分支的第一个关键酶BIS可以催化苯甲酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A产生的中间产物3,5-二羟基联苯。但是在由3,5-二羟基联苯最终转变为稳定且有生物学功能的联苯和氧芴的过程中,尚需要多步反应,目前对这些反应及其相关酶也还不清楚。甲基化反应是这些反应之中很重要的反应之一,在欧洲花楸中还没有甲基转移酶基因被分离的报道。但是最近在经壳聚糖诱导的欧洲花楸细胞总蛋白中,检测到了甲基转移酶的活性,该酶能将3,5-二羟基联苯转化为3-甲氧基-5-羟基联苯。本实验室根据已经建立的联苯和氧芴生物合成诱导体系,进一步构建了一个差异表达的消减cDNA文库,结合ESTs测序和数据库检索等方法筛选出了一批与联苯和氧芴生物合成相关的候选基因。其中有两个不同的ESTs片段与甲基转移酶基因有较高的同源性(相似性约50％～75％)。利用RACE的方法将这两个基因扩增全长,发现这两个ESTs为同一基因的不同片段,将它命名为欧洲花楸甲基转移酶基因(SaOMT)。该基因包含一个全长为1068bp的开放阅读框,编码355个氨基酸。用DNAStar预测蛋白大小为39.8kDa,等电点为5.2。进一步分析核酸序列发现,SaOMT与辣薄荷(Menthaxpiperita)的类黄酮7’-O-甲基转移酶有42％的相似性。SaOMT从结构上届于第二类甲基转移酶,即咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeic acid-O-methyltransferase,COMT),其表达受外源诱导子调控。但是该酶体外和植物体内的功能还需要进一步研究。